一种金属硫蛋白基因MT18、其编码得到的金属硫蛋白及其表达和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种金属硫蛋白基因MT18，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，来源于土壤微生物，该金属硫蛋白基因重金属耐受性好，在1.0M浓度镉溶液中仍然可以存活生长。并且对镉金属富集效应明显，因而在重金属污染治理等行业具有较大的应用潜力。

Metallothionein gene MT18, its encoding metallothionein and its expression and Application

The invention discloses a metallothionein gene MT18, whose base sequence is shown as SEQ ID NO:1 and originates from soil microorganisms. The metallothionein gene has good tolerance to heavy metals and can survive and grow in 1.0M cadmium solution. It has obvious effect on cadmium enrichment, so it has great potential in heavy metal pollution control and other industries.

【技术实现步骤摘要】
一种金属硫蛋白基因MT18、其编码得到的金属硫蛋白及其表达和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种金属硫蛋白基因、其编码得到的金属硫蛋白及其表达和应用。
技术介绍
金属硫蛋白(metallothionein，简称MT)是一类普遍存在于生物体内的金属结合蛋白。金属硫蛋白是具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质。富含半胱氨酸的短肽，对多种重金属有高度亲和性。它是分子质量较低，半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。重金属生物修复是利用生物材料进行重金属治理的技术，而重金属抗性基因是生物修复的重要资源。基于基因改造的生物材料可以突破自然生物材料的性状限制，获得生物量、生长速度和修复效率的优化组合，来自微生物的重金属抗性基因已经在高效修复生物材料的开发方面显示出巨大的潜力。早在1998年，NatureBiotechnology(Rughetal.,1998)就报道了稳定表达细菌汞还原基因merA的黄杨(yellowpoplar，又译作鹅掌楸)，该转基因植物展示了一种生态友好的植物修复途径。来自沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的砷甲基化基因arsM最近被用于了构建基因工程菌，该工程菌展示了高效修复砷污染土壤的潜力(Chenetal.,2014)。少数研究也展示了基因改造生物材料在镉污染修复上的潜力。例如，Shim等人将酵母的镉抗性基因YCF1转入杨树，促进了该植株在镉污染土壤中的生长，也增强了该植株的镉富集能力(Shimetal.,2013)；Kang等人将三个微生物镉抗性基因SpPCS、GshI和MntA转入大肠杆菌，使转基因菌株的镉富集能力提高了25倍(Kangetal.,2007)。现阶段对于重金属耐受/富集效果的金属硫蛋白来源往往来自于动物、植物，对微生物来源的金属硫蛋白研究较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于获得一种重金属耐受/富集效果的金属硫蛋白基因，从而得到由其编码的金属硫蛋白，进而将其应用于重金属污染治理领域中。本专利技术第一方面是提供一种，金属硫蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示，由该基因编码得到的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术通过以下步骤分离得到上述金属硫蛋白基因：S1.用铜溶液污染土壤，避光恒温25度培养14天S2.使用商用DNA提取试剂盒提取土壤全基因组S3.使用二代Illumia测序平台HiSeq对基因组进行全测序S4.通过通用生物信息学方法对测序序列进行质检、过滤、组装S5.从公开基因数据库UniProt和GenBank中搜索所有有关的金属硫蛋白基因序列S6.手动检查所述金属硫蛋白基因序列可靠性，编号后将可靠金属硫蛋白基因序列汇总，经软件翻译形成金属硫蛋白氨基酸序列数据库，所述金属硫蛋白氨基酸序列数据库见SEQIDNO：3～SEQIDNO：54；S7.利用生物信息学检索方法BLAST，在测序组装的土壤基因组中搜索可能的金属硫蛋白基因序列，以所述金属硫蛋白氨基酸序列数据库作为检索模板S8.获得的所述可能的金属硫蛋白基因序列进行手动检查，核对序列的核苷酸偏好性、金属结合位点等信息，进一步确定高可靠性的金属硫蛋白基因序列S9.功能验证9.1将所述高可靠性的金属硫蛋白基因序列通过化学合成获得高可靠性疑似金属硫蛋白序列，所述高可靠性疑似金属硫蛋白序列直接连接至pET28a(+)质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到转化菌株；9.2通过DropAssay试验测定所述大肠杆菌BL21(DE3)及所述转化菌株的镉抗性，使用所述大肠杆菌BL21(DE3)作为对照，当最小抑制浓度下该转化菌株成活，认为所述高可靠性的金属硫蛋白基因序列为有功能/活性的金属硫蛋白基因；9.3通过测定生长管内600nm处吸光值获得所述大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线；9.4收获生长曲线测定中的所述大肠杆菌BL21(DE3)；9.5通过强酸消解所述大肠杆菌BL21(DE3)，使用原子吸收测定溶液镉浓度并计算所述大肠杆菌BL21(DE3)内镉吸收量。本专利技术的优点和有益效果为：本专利技术公开的金属硫蛋白基因，来源于土壤微生物，该金属硫蛋白基因重金属耐受性好，在1.0M浓度镉溶液中仍然可以存活生长。并且对镉金属富集效应明显，因而在重金属污染治理等行业具有较大的应用潜力。附图说明图1是本专利技术公开的大肠杆菌在不同浓度镉溶液中的生长情况。图2是本专利技术公开的大肠杆菌生长曲线。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。实施例一金属硫蛋白基因筛选获得的过程：S1.用铜溶液污染土壤，避光恒温25度培养14天；S2.使用商用DNA提取试剂盒(DNeasyPowerMaxSoilKit)按照其说明书规定流程进行操作提取土壤全基因组，凝胶电泳测定DNA质量；S3.提交商业测序，使用二代Illumia测序平台HiSeq对基因组进行全测序S4.通过通用生物信息学方法对测序序列进行质检、过滤、组装S5.从公开基因数据库UniProt和GenBank中搜索所有有关的金属硫蛋白基因序列S6.手动检查所述金属硫蛋白基因序列可靠性，编号后将可靠金属硫蛋白基因序列汇总，经过软件翻译形成金属硫蛋白氨基酸序列数据库，所述金属硫蛋白氨基酸序列数据库见SEQIDNO：3～SEQIDNO：54；S7.利用生物信息学检索方法BLAST，在测序组装的土壤基因组中搜索可能的金属硫蛋白基因序列，以所述金属硫蛋白氨基酸序列数据库作为检索模板，S8.获得的所述可能的金属硫蛋白基因序列进行手动检查，核对序列的核苷酸偏好性、金属结合位点等信息，进一步确定高可靠性的金属硫蛋白基因序列，所述可靠性的金属硫蛋白基因序列碱基序列如SEQIDNO：1所示，编号为MT18。实施例二9.1将所述高可靠性的金属硫蛋白基因序列MT18通过化学合成获得高可靠性疑似金属硫蛋白序列如SEQIDNO：2所示(通过商业公司GENEWIZ,Suzhou,完成)，所述高可靠性疑似金属硫蛋白序列直接连接至pET28a(+)质粒，质粒通过电转化转入宿主大肠杆菌Escherichiacoli(E.coli)BL21(DE3)，得到转化菌株；实施例三功能验证的详细过程。9.2最小抑制浓度(MIC)，通过测量不同Cd浓度培养基中细菌细胞的生长能力来评估Cd的MIC值。首先，含有转化菌株的MT18及其相应的空白对照(空pET28a(+))在LauriaBertani(LB)-琼脂平板上于29℃生长过夜。然后，将含有细菌菌落的重组质粒扩散到含有各种浓度(0-16mM)Cd(包括卡那霉素(50mg/L))和诱导剂(IPTG-Isopropyl-B-D-1-thiogalactopyranoside，100mg/L)的LB-plate平板中。)测定他们的MIC。测定空白对照大肠杆菌Escherichiacoli(E.coli)BL21(DE3)，Cd最小抑制浓度，DropAssay试验测定所述大肠杆菌BL21(DE3)；见图1，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金属硫蛋白基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种金属硫蛋白基因，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。2.一种金属硫蛋白，其特征在于，所述金属硫蛋白由权利要求1所述的基因编码得到，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.包含权利要求1所述的金属硫蛋白基因的重组载体。4.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体为大肠杆菌表达载体。5.包含权利要求1所述的金属硫蛋白基因的重组菌株。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小方，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，
类型：发明
国别省市：河北,13