一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及金属硫蛋白提取技术领域，公开了一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法。通过氯化锌诱导、多次离心提取、用填料为聚甲基丙烯酸酯的分子筛预装柱一次纯化及阴离子交换层析二次纯化的方法从虾夷扇贝内脏中提取金属硫蛋白。通过本发明专利技术的从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法所获得的两种亚型的混合物及两种亚型的单品的纯度高。并且，该方法的提取过程简单，且选用虾夷扇贝内脏为原料进行金属硫蛋白的提取，充分利用企业加工的下脚料，提高了虾夷扇贝的经济价值。

A method for simultaneous extraction of two subtypes of metallothionein from scallops

The invention relates to the technical field of metallothionein extraction, and discloses a method for simultaneously extracting two subtypes of metallothionein from scallops. Metallothionein was extracted from scallop viscera by zinc chloride induction, multi-centrifugal extraction, one-time purification with molecular sieve pre-packed column filled with polymethacrylate and second purification with anion exchange chromatography. The mixture of two subtypes of metallothionein obtained by the method of simultaneously extracting two subtypes of metallothionein from the scallop and the single product of the two subtypes have high purity. Moreover, the extraction process of this method is simple, and the viscera of scallop is selected as raw material to extract metallothionein, which makes full use of the waste material processed by enterprises and improves the economic value of scallop.

【技术实现步骤摘要】
一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法
本专利技术涉及金属硫蛋白提取
，尤其涉及一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法。
技术介绍
金属硫蛋白分子量低、巯基含量高，能大量结合重金属离子。它是一种目前所知的最有效的自由基清除剂，其清除自由基(·OH)的能力约为SOD的几千倍，而清除氧自由基(·O)的能力约是谷胱甘肽(GSH)的25倍，而且具有很强的抗氧化活动。目前金属硫蛋白多从兔肝、猪肝及植物中提取，从水生物中提取金属硫蛋白的研究较少。由于从不同的水生物中提取金属硫蛋白的方法和参数不尽相同，因此，从不同来源的水生物中提取金属硫蛋白的可参考性差。中国专利申请公开号为CN104910273A的专利，公开了一种海洋生物源高效重金属脱除剂贝类金属硫蛋白的诱导、提取分离工艺。该方法包括定向诱导、缓冲溶液提取、多级超滤、微滤、纳滤提纯、葡聚糖凝胶与离子交换层析联合分离纯化等步骤。该方法提取的金属硫蛋白的纯度有待提高，且经过该方法仅能提取一种金属硫蛋白，无法同时提取两种及以上的金属硫蛋白纯品。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法。本专利技术的从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法提取过程简单，且选用虾夷扇贝内脏为原料提取，充分利用企业加工的下脚料，提高了虾夷扇贝的经济价值。利用本专利技术的提取方法所获得的两种亚型的混合物及两种亚型的单品，纯度高。本专利技术的具体技术方案为：一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法，包括以下步骤：（1）诱导：将活的虾夷扇贝暴露在氯化锌溶液中诱导；（2）提取：取诱导后的虾夷扇贝的内脏，匀浆，离心提取，得到金属硫蛋白粗提物；（3）一次纯化：将金属硫蛋白粗提物复溶，离心，用滤膜过滤，然后，进行柱色谱分离，收集洗脱液，将洗脱液冷冻干燥，获得虾夷扇贝内脏源两种亚型金属硫蛋白的混合物；（4）二次纯化：取两种亚型金属硫蛋白的混合物复溶，用滤膜过滤，然后，进行阴离子交换层析分离，以NaCl溶液为流动相，收集洗脱液，用巯基试剂进行点滴检测，当巯基试剂显色时，将洗脱液进行脱盐处理，再次收集脱盐后的洗脱液，真空冷冻干燥即可得到两种亚型金属硫蛋白。本专利技术采用虾夷扇贝的内脏作为提取金属硫蛋白的来源，经过氯化锌诱导、提取、两次纯化步骤得到两种亚型的金属硫蛋白。利用本专利技术的提取方法提取的金属硫蛋白的纯度高，且能够同时获得两种亚型金属硫蛋白纯品。现有技术中，虽然利用阴离子交换HPLC和电感耦合等离子体发射光谱仪能够实现两种亚型金属硫蛋白的分离，但是，利用该技术方法只能将两种亚型金属硫蛋白分开，样品经过电感耦合等离子体发射光谱仪后会被离子化，导致无法收集得到金属硫蛋白。本专利技术首先利用氯化锌对虾夷扇贝进行诱导，使其产生更多的金属硫蛋白。然后将虾夷扇贝的内脏均浆后用Tris-HCl缓冲液溶解稀释，并用还原剂TCEP进行还原，经过多次离心提取获得纯度为80%的金属硫蛋白粗提物。金属硫蛋白粗提物复溶后，离心去除不溶性杂质，通过滤膜去除悬浮的大分子物质，然后经填料为聚甲基丙烯酸酯分子筛预装柱分离后获得纯度为87%的两种亚型的混合物。最后，将两种亚型的混合物复溶后，通过滤膜去除悬浮的大分子物质，再利用DEAE系列树脂进行阴离子交换层析分离，并进行脱盐处理，获得两种亚型金属硫蛋白。本专利技术采用NaCl溶液作为流动相进行两种亚型金属硫蛋白的分离，现有技术中，多采用不同浓度的Tris-HCl缓冲液作为阴离子交换层析的流动相。然而，Zn-金属硫蛋白在220nm处有吸收，所以在220nm处判断提取到的金属硫蛋白与Zn结合。以Tris-HCl缓冲液作为流动相时，由于Tris-HCl缓冲液本身在220nm处有很强的吸收，对检测结果有影响，无法将两种亚型金属硫蛋白完全分离。因此，以Tris-HCl缓冲液作为流动相时，以紫外光谱检测无法将两种亚型金属硫蛋白分开，只能采用电感耦合等离子体检测，然而，金属硫蛋白经过电感耦合等离子体后将被离子化而导致无法收集。按照两种亚型金属硫蛋白在离子交换色谱中的洗脱顺序分别称为金属硫蛋白1和金属硫蛋白2，NaCl溶液为中性的溶液，金属硫蛋白在中性溶液中以结合金属的形式存在。同时，由于NaCl溶液在190~200nm处有紫外吸收，因此对结合Zn的金属硫蛋白的紫外吸收峰不存在干扰。同时，由于金属钠离子在负电势孔道中的结合稳定了金属硫蛋白二聚体的构象，静电势分析表明，虾夷扇贝内脏源金属硫蛋白亚型1以二聚体形式存在，而金属硫蛋白亚型2以三聚体形式存在，二者的分子大小存在差别，同时二者与NaCl溶液中的钠离子的作用能力也不相同，因此，采用NaCl溶液作为流动相时，能够将两种亚型金属硫蛋白完全分开。当NaCl溶液中的氯离子换成其他的阴离子时，两种亚型金属硫蛋白的构象会发生变化，将无法将两种金属硫蛋白完全分开。由于不同来源的水生物提取金属硫蛋白的工艺及处理参数各不相同，因此，本专利技术的提取方法仅针对于虾夷扇贝内脏中金属硫蛋白的提取，对其他来源的金属硫蛋白的提取可能并不适用，与此同时，其他来源的金属硫蛋白的提取方法对本专利技术的参照性也不强。作为优选，步骤（4）中，所述阴离子交换层析分离的条件为：NaCl溶液的浓度为0.15~0.5mol/L，流速0.8~1.2ml/min，上样量为0.8~1mL，检测波长220nm。本专利技术以0.15~0.5mol/L的NaCl溶液的作为流动相，在流速为0.8~1.2ml/min的条件下通过DEAE系列树脂对两种亚型的混合物进行阴离子交换层析分离。不同来源的金属硫蛋白的特性存在一定的差异，所以分离过程中所用的流动相各不相同。经过大量的实验，本专利技术人发现，NaCl溶液做流动相结果比Tris-HCl缓冲液好，当以0.15~0.5mol/L的NaCl溶液，特别是以0.5mol/L的NaCl溶液作为流动相时，两种亚型金属硫蛋白能够完全分离，同时，两种亚型的混合物中的其他杂质也可以去除。当改变NaCl溶液的浓度和流速时，虽也能将两种金属硫蛋白分离，但得到的两种金属硫蛋白的分离度不高，且两种亚型的混合物中的其他杂质也无法完全去除。因此，以虾夷扇贝的内脏作为来源提取金属硫蛋白时，要同时获得两种亚型金属硫蛋白纯品，必须要采用本专利技术提供的提取、纯化方法和工艺参数，否则将无法获得理想纯度的两种亚型金属硫蛋白。作为优选，步骤（2）中，所述提取方法为：取诱导后的虾夷扇贝的内脏，匀浆，加入Tris-HCl缓冲液和还原剂TCEP，2~4℃过夜，离心，收集上清液a加热至65~75℃保持3~8min，快速冷却后离心，收集上清液b，加入乙醇沉淀过夜，2~4℃条件下将沉淀物分离，弃去上清液，向沉淀中加入Tris-HCl缓冲液，室温下溶解3~4h，再次离心，将上清液c冷冻干燥后得到金属硫蛋白粗提物。本专利技术选用Tris-HCl缓冲液对虾夷扇贝内脏进行稀释溶解，并用TCEP对金属硫蛋白的二硫键进行定量还原，离心去除虾夷扇贝内脏中的不溶性杂质后，将上清液加热至65~75℃保持3~8min，70℃左右的水处理能够将上清液中的大分子杂蛋白沉降。处理温度过高会引起金属硫蛋白的流失。向上清液b中加入乙醇沉淀过夜能够进一步将上清液中的大分子杂蛋白与金属硫蛋白分离，金本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）诱导：将活的虾夷扇贝暴露在氯化锌溶液中诱导；（2）提取：取诱导后的虾夷扇贝的内脏，匀浆，离心提取，得到金属硫蛋白粗提物；（3）一次纯化：将金属硫蛋白粗提物复溶，离心，用滤膜过滤，然后，进行柱色谱分离，收集洗脱液，将洗脱液冷冻干燥，获得虾夷扇贝内脏源两种亚型金属硫蛋白的混合物；（4）二次纯化：取两种亚型金属硫蛋白的混合物复溶，用滤膜过滤，然后，进行阴离子交换层析分离，以NaCl溶液为流动相，收集洗脱液，用巯基试剂进行点滴检测，当巯基试剂显色时，将洗脱液进行脱盐处理，再次收集脱盐后的洗脱液，真空冷冻干燥即可得到两种亚型金属硫蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）诱导：将活的虾夷扇贝暴露在氯化锌溶液中诱导；（2）提取：取诱导后的虾夷扇贝的内脏，匀浆，离心提取，得到金属硫蛋白粗提物；（3）一次纯化：将金属硫蛋白粗提物复溶，离心，用滤膜过滤，然后，进行柱色谱分离，收集洗脱液，将洗脱液冷冻干燥，获得虾夷扇贝内脏源两种亚型金属硫蛋白的混合物；（4）二次纯化：取两种亚型金属硫蛋白的混合物复溶，用滤膜过滤，然后，进行阴离子交换层析分离，以NaCl溶液为流动相，收集洗脱液，用巯基试剂进行点滴检测，当巯基试剂显色时，将洗脱液进行脱盐处理，再次收集脱盐后的洗脱液，真空冷冻干燥即可得到两种亚型金属硫蛋白。2.根据权利要求1所述的一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述阴离子交换层析分离的条件为：NaCl溶液的浓度为0.15~0.5mol/L，流速0.8~1.2ml/min，上样量为0.8~1mL，检测波长220nm。3.根据权利要求1所述的一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述提取方法为：取诱导后的虾夷扇贝的内脏，匀浆，加入Tris-HCl缓冲液和还原剂TCEP，2~4℃过夜，离心，收集上清液a加热至65~75℃保持3~8min，快速冷却后离心，收集上清液b，加入乙醇沉淀过夜，2~4℃条件下将沉淀物分离，弃去上清液，向沉淀中加入Tris-HCl缓冲液，室温下溶解3~4h，再次离心，将上清液c冷冻干燥后得到金属硫蛋白粗提物。4.根据权利要求3所述的一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.008~0.012mol/L，pH为8~8.5，温度为2~4℃，虾夷扇贝内脏与Tris-...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟春英，张小军，李停停，梅光明，
申请(专利权)人：浙江省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33