The invention discloses a method for evaluating the effect of PM2.5 whole chemical component particles on intracellular free radical metabolism. By exposing human lung bronchial epithelial cells to PM2.5 particles, the metabolites of small and medium molecules in cells were effectively analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the enzymatic activities were rapidly analyzed by biological detection methods. The changes of metabolites of small molecules related to intracellular free radical metabolism and the rate-limiting enzymes that play a key role in energy metabolism were integrated. In summary, based on molecular biology, a new method for evaluating the interference of oxygen free radical metabolism in cells exposed to exogenous pollution toxicity was developed. The method can intuitively analyze the effect of pollutants on intracellular free radical metabolic pathway, and has the advantages of simple pretreatment method, fast detection, good repeatability, and comprehensive information acquisition.
【技术实现步骤摘要】
一种PM2.5颗粒对人肺细胞内自由基代谢通路影响的评估方法
本专利技术属于大气颗粒物毒性评价领域，涉及一种基于分子生物学及分析化学的评估方法，通过大气颗粒物对细胞能量代谢通路的改变来评估小剂量环境污染物的细胞毒性。
技术介绍
大气细颗粒物(Atmosphericfineparticles)其组成复杂，空气动力学直径小于2.5μm颗粒物(PM2.5，可入肺颗粒物)是本专利权益的核心聚焦物质,其具有远距离环境迁移的能力、环境持久性以及生物蓄积等特性。PM2.5颗粒组分是复杂的，非均相混合物，颗粒物本身属于类难溶颗粒，在时间和空间上存在很大的可变因素，其组分包含了许多不同的化学成分并具有相近的物理特性，PM2.5的化学成分包括硫酸盐，硝酸盐，铵等；水溶性无机离子如钠，钾，钙，镁和氯等；有机和元素碳，碳黑，地壳物质，颗粒结合水，二氧化钛，金属(包括镉，铜，镍离子，钒和锌)和多环芳烃(PAH)等；此外，生物组分，例如过敏原和微生物化合物存在其中。人类排放活动进一步结合地形和气象条件会导致更高的城市空气污染，地中海地区的许多研究发现，短期和长期暴露于环境可吸入肺颗粒物与呼吸系...
【技术保护点】
1.一种PM2.5全化学组分颗粒对人肺细胞内自由基代谢通路影响的评估方法，其特征在于以下步骤：(a)原代培养人肺上皮细胞接种于六孔板，接种密度为1×10
【技术特征摘要】
1.一种PM2.5全化学组分颗粒对人肺细胞内自由基代谢通路影响的评估方法，其特征在于以下步骤：(a)原代培养人肺上皮细胞接种于六孔板，接种密度为1×105个/mL六孔板内每孔加入培养液体积为3mL；在培养箱培养24-48h(37℃，5％CO2)，待细胞进入对数生长期覆盖培养板80％后；用PM2.5全化学组分颗粒对人肺细胞进行暴露，即移弃原培养液，每孔加入PM2.5全化学组分颗粒的培养液3mL，以保证细胞生长营养需求，在原条件下培养24小时后收取细胞；(b)步骤a所得细胞样品提取细胞内小分子代谢产物；利用基于LC-MS的质谱方法对小分子代谢产物进行定量分析；(c)步骤a所得细胞样品，经超声破碎制得悬液，测定与能量代谢相关酶的活性；所述加入含PM2.5全化学组分颗粒的培养液为1～4mL，优选3mL，浓度为10μg/mL-250μg/mL。2.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于：步骤b)中提取细胞内小分子代谢产物的过程具体分为两步：第一步，脂肪酸提取，移弃培养液，每孔加入1ml18.2MΩ超纯水清洗，废液弃完全且无残留，每孔加满液氮淬灭细胞；待液氮挥发后，每孔加入0.5ml18.2MΩ超纯水，超声破碎1～10min，优选5min，破碎后的悬液移出，尽量保证无细胞碎片残留，转移完全，，置于EP管中于-60～-30℃，优选-40℃冷冻干燥,冻干后加入10～20μL，优选20μL内标混合液(正亮氨酸浓度为200nmol/L，十一酸浓度为10mg/L，十九酸浓度为10mg/L，溶剂为乙腈)，涡旋混匀；加入400μLMTBE涡旋提取20min，加入260μL水涡旋5min混匀，12000rpm/min、4℃下离心20min，取上清氮气吹干，乙腈定容，LC-MS分析游离脂肪酸；第二步，氨基酸，葡萄糖，乳酸的提取，脂肪酸提取后剩余部分依次加入100μLMTBE和130μL甲醇，涡旋震荡20min，12000rpm/min、4℃下离心20min，取下层直接用于串联四极杆复合线性离子阱质谱分析。3.根据权利要求2所述的研究方法，其特征在于：在小分子代谢产物定量分析中，非极性组分游离脂肪酸的分离色谱柱为UfavourC8柱(waters,150mm×2.1mm,3.0μm)，流动相A为H2O，B为含1-5mM乙酸铵的乙腈，C为乙腈；流动相梯度为(时间，B和C的体积百分数，流速)：0-5min,20％B,70％C,250μL/min；在1分钟内C由70％增加为80％；7-15min,20％B,80％C,250μL/...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋肖垚，陈吉平，耿柠波，张海军，张亦弛，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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