水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，水凝胶微载体由水溶性高分子、多糖和蛋白质组分中的一种或多种水溶性合成高分子，经过化学交联或光交联得到的。水溶性合成高分子选自明胶、甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、丝素、壳聚糖和胶原蛋白中的一种或几种混合。本发明专利技术制备的水凝胶微载体能够作为细胞培养载体，能够用于细胞的黏附、扩增、原位冻存和收获；细胞收获时，采用的胶原酶消化液或者胶原酶与胰酶混合液能够降解水凝胶微载体，这样便可以收获所有的细胞，且收集过程方便易操作。

Application of Hydrogel Microcarriers in Cell Adhesion, Amplification, Cryopreservation and Digestion

The invention discloses the application of hydrogel microcarriers in cell adhesion, expansion, freezing and digestion. Hydrogel microcarriers are synthesized from one or more water-soluble polymers, polysaccharides and protein components by chemical or optical crosslinking. Water-soluble synthetic polymers are selected from one or several mixtures of gelatin, methacrylated gelatin, sodium alginate, silk fibroin, chitosan and collagen. The hydrogel microcarrier prepared by the invention can be used as a cell culture carrier, and can be used for cell adhesion, expansion, in situ freezing and harvesting; when cells are harvested, the hydrogel microcarrier can be degraded by the collagenase digestion solution or the mixture of collagenase and trypsin, so that all cells can be harvested, and the collection process is convenient and easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用
本专利技术属生物
，涉及可用于贴壁型细胞黏附与扩增的水凝胶微载体技术以及可降解该微载体的裂解液体系技术，具体涉及水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用。
技术介绍
细胞的体外高效扩增是对细胞进行基础研究和功能研究的前提与关键。目前，二维细胞培养皿是最常用的细胞体外扩增系统(Merten2015)。但是，这一系统还存在着一些无法解决的问题。首先，二维培养系统的低空间和培养基利用率使得其在大规模扩增细胞上受到局限，从而无法完全满足临床研究和治疗的需求。其次，普通二维培养系统的材料、生物信号、力学性质和拓扑结构等性能都与体内环境有很大的不同。这导致在通过使用二维培养皿传代培养之后，细胞无法完全保持其在体内的功能、形态和基因表达。因此，对细胞体外大规模扩增系统的研究受到越来越多人的关注。在这一方面，三维微载体系统作为一种细胞培养工具表现出极大的优势：1、三维微载体能够在有限的空间里为细胞的大规模扩增提供足够大的表面积；2、对微载体材料、携带的生物分子、拓扑结构等性能的选择与改进，可以让细胞的培养环境与体内的更接近。3、微载体与生物反应器的联合使用能够方便地检测细胞培养过程中的各项指标(氧含量、pH和营养物质等)。三维微载体培养系统的研究包括细胞黏附、增殖、传代、冻存和消化等方面。其中，细胞的消化是收获所得细胞的关键步骤。微载体系统的细胞消化方式主要有两大类：保留微球的细胞消化方式和降解微球的细胞消化方式。前一种消化方式，难以收获所有的细胞，且在细胞消化之后需要采取一定的措施将细胞与微球分离。专利
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术提供了水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，水凝胶微载体由水溶性高分子、多糖和蛋白质组分中的一种或多种水溶性合成高分子，经过化学交联或紫外交联得到的。进一步地，水溶性合成高分子选自明胶、甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、丝素、壳聚糖和胶原蛋白中的一种或几种混合。进一步地，水凝胶载体的形状为微球，微球的直径为50-1,000微米。本专利技术中的水凝胶载体还可以为其他形状。进一步地，水凝胶微载体由以下步骤制备得到：甲基丙烯酸酐化明胶与交联剂在紫外照射的条件下，交联形成水凝胶微载体，此处的水凝胶微载体为甲基丙烯酸酐化明胶微载体，其中，交联剂为苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，交联剂的质量体积浓度在1mg/mL-100mg/mL之间；甲基丙烯酸酐化明胶的质量体积浓度在10mg/mL-1000mg/mL之间；交联时，交联剂与甲基丙烯酸酐化明胶的体积配比在0.001-0.1之间。进一步地，水凝胶微载体可被酶降解液降解，酶降解液为胶原酶，胶原酶浓度为0.0005-0.02g/mL，其中，溶剂是1％PBS(pH＝7.4)。进一步地，水凝胶微载体可被酶降解液降解，酶降解液为胶原酶与胰酶的混合液，胶原酶浓度在0.0005-0.02g/mL，胰酶浓度在0.0001-0.005g/mL，其中，溶剂均为1％PBS(pH＝7.4)。进一步地，所述水凝胶微载体也可用于装载细胞生物活性因子。进一步地，装载的细胞生物活性因子包括bFGF、EGF、PDGF、ActA、BMP-2、BMP-4、ITS、TGF-b3、地塞米松和维他命C。进一步地，水凝胶微载体可由3D打印或微流控方法制得。可以用3D打印或微流控或其他制备微球的方法将甲基丙烯酸酐化明胶与交联剂混合溶液制备成甲基丙烯酸酐化明胶微球。进一步地，甲基丙烯酸酐化明胶由以下步骤制备得到：将明胶溶解于水中，得到明胶水溶液，向明胶水溶液中加入甲基丙烯酸酐，25-80摄氏度反应2-6小时，将反应混合液进行透析，冷冻干燥透析后的溶液，得到甲基丙烯酸酐化明胶，保存备用；其中，制备甲基丙烯酸酐化明胶时，甲基丙烯酸酐与明胶的体积质量之比在0.1-0.8之间。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术制备的水凝胶微载体能够作为细胞培养载体，能够用于细胞的黏附、扩增、原位冻存和收获；细胞收获时，采用的胶原酶消化液或者胶原酶与胰酶能够降解水凝胶微载体，这样便可以收获所有的细胞，且收集过程方便易操作。(2)本专利技术的水凝胶微载体可以在-80度冷冻保存，经过冻存的微载体仍可用于培养细胞，实现细胞的黏附、扩增与消化，可减少细胞传代的影响同时为细胞的储存与运输提供了有效的途径。(3)本专利技术采用胶原酶消化液或者胶原酶与胰酶混合液能够快速降解水凝胶微载体，例如直径为300-500微米的微球，能够在3-5分钟内完全被降解，降解时间短，降解速度快。(4)本专利技术制备的水凝胶微载体也可用于装载生物活性因子，促进细胞增殖。(5)本专利技术制备的水凝胶微载体可用于干细胞、常规原代细胞及其他传代细胞的黏附、增殖、原位冻存、运输和收获；干细胞在水凝胶微载体上的黏附率和包裹率可达80％以上；干细胞在水凝胶微载体上培养4-7天，细胞可以扩增至细胞种植数量的4倍以上；干细胞可在水凝胶微载体上于-80℃和液氮条件下原位冻存。干细胞可在水凝胶微载体被酶降解后收获。附图说明图1是实施例4中拍摄的脂肪间充质干细胞在甲基丙烯酸酐化明胶微球上的黏附与增殖的显微镜图。图2是实施例6中拍摄的甲基丙烯酸酐化明胶微球降解过程的显微镜图。图3是实施例5中拍摄的不同浓度的胶原酶对甲基丙烯酸酐化明胶微载体的降解过程的显微镜对比图。图4是实施例7中拍摄的冻存之后的甲基丙烯酸酐化明胶微载体用于细胞培养的显微镜观察图。图5是实施例7中拍摄的冻存之后的甲基丙烯酸酐化明胶微载体在细胞消化过程的显微镜观察图。具体实施方式以下将结合附图对本专利技术的具体实施方案做进一步详细说明，应当指出的是，实施例只是对本专利技术的具体阐述，不应视为对本专利技术的限定。明胶购自于Sigma试剂公司，甲基丙烯酸酐购自于Aladdin试剂公司，其他所用到的试剂也是购买所得。实施例1甲基丙烯酸酐化明胶的制备：称取50克明胶于500毫升单蒸水中，并置于40摄氏度水浴锅中，加热溶解。将溶解的明胶溶液置于磁力搅拌器上，转速为1,000转每分钟，温度为55摄氏度，置于通风橱中。边搅拌边缓慢逐滴加入5毫升甲基丙烯酸酐，50摄氏度，反应4小时。将反应混合溶液装入透析袋中(该透析袋的截留分子量是8KD～14KD)，置于双蒸水中透析，放在磁力搅拌器上，转速为310转每分钟，温度为50摄氏度，每两天换一次水。一周后，取出透析袋中的胶体溶液，4摄氏度放置4小时后，转移到-80摄氏度过夜。冷冻干燥4天后，-80摄氏度密封保存。实施例2甲基丙烯酸酐化明胶微球的准备：称取1克冻干后的甲基丙烯酸酐化明胶于10毫升1％PBS(pH＝7.4)中，置于40摄氏度水浴锅中溶解。溶解之后(约半小时，完全溶解)，加入25微升0.04g/mL的光敏剂和7.5微升0.004g/mL的酚红(溶剂为双蒸水)，121摄氏度高温灭菌8分钟。灭菌后的甲基丙烯酸酐化明胶通过3D打印的方法制备成甲基丙烯酸酐化明胶微球(此处，甲基丙烯酸酐化明胶微球作为水凝胶微载体)。通过3D打印，可以得到直径在10微米及以上的微球。交联是在3D打印的过程中完成的，3D打印机有紫外交联的过程，本实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，其特征在于，水凝胶微载体由水溶性高分子、多糖和蛋白质组分中的一种或多种水溶性合成高分子，经过化学交联或光交联得到的。

【技术特征摘要】
1.水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，其特征在于，水凝胶微载体由水溶性高分子、多糖和蛋白质组分中的一种或多种水溶性合成高分子，经过化学交联或光交联得到的。2.根据权利要求1所述的水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，其特征在于，水溶性合成高分子选自明胶、甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、丝素、壳聚糖和胶原蛋白中的一种或几种混合。3.根据权利要求1所述的水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，其特征在于，水凝胶微载体的形状为微球，微球的直径为50-1,000微米。4.根据权利要求1所述的水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，其特征在于，水凝胶微载体由以下步骤制备得到：甲基丙烯酸酐化明胶与交联剂在紫外光照射的条件下，交联形成水凝胶微载体，其中，交联剂为苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，交联剂的质量体积浓度在1mg/mL-100mg/mL之间；甲基丙烯酸酐化明胶的质量体积浓度在10mg/mL-1000mg/mL之间；交联时，交联剂与甲基丙烯酸酐化明胶的体积配比在0.001-0.1之间。5.根据权利要求4所述的水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，其特征在于，水凝胶微载体可被酶降解液降解，酶降解液为胶原酶，胶原酶浓度为0.0005-0.02g/mL，其中，溶剂是1％PBS(pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳宏伟，何秋琳，张靖微，廖友国，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33