调节重组蛋白生产状况的方法技术

本发明专利技术涉及在细胞培养基中培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法和组合物，所述细胞培养基补充了包含有效量戊酸的补料，由此，相比不用含戊酸补料条件下生长的细胞，细胞活力提高且所述蛋白质的生产增加。

Methods for regulating the production of recombinant protein

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调节重组蛋白生产状况的方法
本专利技术属于细胞培养领域。具体地说，本专利技术涉及在细胞培养基中培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法，所述细胞培养基补充了包含有效量戊酸的补料，从而使得所述宿主细胞的活力和所述蛋白质的生产高于无戊酸补料培养的细胞。
技术介绍
过去20年中，生物制药公司致力于寻找能够促进细胞生长和重组蛋白生产力的化合物。许多作者报道称小分子添加剂对比生产力有积极影响，通常是因为它们将细胞培养物阻留在G0期[1]，这正是对生产而言最重要的相期。其中，羧酸对于培养物的表现有最大影响。它们被发现抑制HDAC1活性(组蛋白去乙酰化酶1)[2]。但是，在培养过程中添加化合物，既便可能提高效价，通常会降低质量。这些化合物还会有细胞毒性和凋亡活性。因此，许多方案意图通过比较不同的羧酸并研究它们对于效价和质量的影响来寻找对蛋白质危害更低的添加剂。所以，需要能够安全培养宿主细胞并增加重组蛋白生产的培养条件和生产方法。本专利技术为此提供了方法和组合物用于增加重组蛋白生产，同时改善宿主细胞活力。专利技术概述一方面，本专利技术提供一种增加重组蛋白生产的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞，所述细胞培养基补充了至少一份包含有效量戊酸的补料。另一方面，本专利技术提供一种培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养所述宿主细胞，所述细胞培养基补充了至少一份包含有效量戊酸的补料。另一方面，本专利技术提供一种补料组合物，其包含有效量的戊酸。另一方面，本专利技术提供戊酸作为补料用于细胞培养来增加重组蛋白生产的用途。另一方面，本专利技术提供戊酸作为诱导剂用于细胞培养的用途。附图说明图1显示用不同浓度戊酸、不同补料时机培养的表达蛋白P1的宿主细胞的活细胞密度(A)、活力(B)和效价(C)。图1A、1B和1C的图例如图1D中所述。图2显示不同时机添加1.5mM戊酸来培养的表达抗体P2的宿主细胞的活细胞密度(A)、活力(B)和效价(C)。图2A、2B和2C的图例如图2D中所述。两图中：VA＝戊酸，WD＝工作日(即向细胞培养物中加戊酸的日子)专利技术详述本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体纳入。除非另外定义，本文所用科技术语的含义与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。按照本文中的使用，提供以下定义以便理解本专利技术。“包含”一词在此普遍表示包括的意思，即允许存在一项或多项特征或组分。在本申请说明书和权利要求中，“包含”可包括用“由……构成或组成”和/或“主要由……构成或组成”之类描述的类似的实施方式。在本申请说明书和权利要求中，“一(个)”、“一(项)”和“所述”等单数形式涵盖复数意义，除非文中明确另有所指。“和/或”用于“A和/或B”之类表述时意在涵盖“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。术语“细胞培养”或“培养”(含复数)指细胞体外(invitro)生长和繁殖，即生物体或组织之外。适合哺乳动物细胞的培养条件是本领域周知的，例如《用于制药和细胞疗法的细胞培养技术》(CellCultureTechnologyforPharmaceuticalandCell-BasedTherapies)(2005)[3]中所授。哺乳动物细胞可悬浮培养或于固体基材上贴附培养。术语“细胞培养基”或“培养基”指可培养任意类型细胞的任意培养基。“基础培养基”指含有供细胞代谢所需所有必要成份的细胞培养基。这包括例如氨基酸、脂类、碳源、维生素和矿物盐。DMEM(达尔伯克改良的伊格尔培养基)、RPMI(斯维·帕克纪念研究所培养基)或F12培养基(哈姆F12(Ham’sF12)培养基)是可商业途径获得的基础培养基的例子。或者，基础培养基可以是完全内部研发的专有培养基，文中亦称“化学组成明确的培养基”，其中所有成份以化学式描述且浓度已知。培养基可不含蛋白质和/或不含血清，并可根据培养的细胞所需补充其他化合物(例如氨基酸、盐、糖类、维生素、激素、生长因子)。术语“补料培养基”或“补料(feed)”(含复数)指培养期间用作补充的培养基(或组合物)，用来补充消耗掉的营养成分和/或提供其他营养成分和/或细胞培养期间所需的其他化合物(例如用于增强或改善细胞生长和重组蛋白生产)。补料培养基可以是可通过商业途径获得的补料培养基或专有补料培养基(在此亦或化学组成明确的补料培养基)。当仅需向培养基中添加特定的化合物(例如戊酸)时，补料可以仅含该化合物，优选呈液态。术语“生物反应器”或“培养系统”指各种可在其中培养细胞(例如灌流式、分批式或批次流加式培养)的系统。该术语包括但不限于烧瓶、静态烧瓶、旋转瓶、管、摇管、摇瓶、波袋、生物反应器、纤维生物反应器、流化床生物反应器和搅拌罐生物反应器，其中有或没有微载体。或者，“培养系统”一词还包括微量滴定板、毛细装置或多孔板。各种大小规格的生物反应器均可使用，例如从0.1毫升(0.1mL，很小规格)到20000升(20000L或20KL，大规格)，例如0.1mL、0.5mL、1mL、5mL、0.01L、0.1L、1L、2L、5L、10L、50L、100L、500L、1000L(或1KL)、2000L(或2K)、5000L(或5KL)、10000L(或10KL)、15000L(或15KL)或20000L(20KL)。“批次流加培养”指这样一种细胞培养方法：其中有批量或连续的补料培养基补加来补充消耗掉的营养成分和/或补充其他营养成分和/或细胞培养期间所需其他化合物(例如用于增强或改善细胞生长和重组蛋白生产)。这样的细胞培养技术能够达到超过10x106至30x106细胞/ml数量级的高细胞密度，具体视培养基配方、细胞系及其他细胞生长条件而定。可用多种补料策略和培养基配方形成和维持双相培养条件。也可采用灌流培育。灌流培育中，细胞接收新鲜灌流补料培养基，同时去除旧培养基。灌流可以是连续的、分步的、间歇式的，或以上全部或部分之任意组合。灌流的速度可以是每日一个工作体积以下至多个工作体积。较好的是，细胞留在培养物中且去除的旧培养基中基本不含细胞或其中的细胞含量显著低于培养物中的细胞含量。灌流可用许多细胞截留技术来实施，这包括离心、沉降或过滤[4]。采用本专利技术的方法和/或细胞培养技术时，重组蛋白一般直接分泌进入培养基。一旦所述蛋白质分泌到培养基中，即可首先对此类表达系统的上清液用可商业途径获得的蛋白质浓缩过滤器进行浓缩。本文中，“细胞密度”指一定体积培养基中的细胞数。“活细胞密度”指一定体积培养基中的活细胞数，例如据标准活力检测所得。如果细胞密度在与对照培养条件(即细胞生长所用补料不含戊酸及其他诱导剂)相差约-10％至+10％的范围内则认为细胞密度得以维持。术语“活力”或“细胞活力”指活细胞总数与培养物中细胞总数之比。活力只要不低于培养起点值60％即认为是可以接受的(但是，可接受的阈值可视情况而定)。活力一般用来确定收获的时机。例如，批次流加培养中，可在活力达到60％或在培养14天后进行收获。“效价”一词指溶液中物质(此处为目标重组蛋白)的量或浓度。它提示溶液被稀释而仍然留有可测量目标分子的可稀释倍数。举例来说它一般如下计算：将含有目标蛋白质的样品连续稀释(1:2、1:4、1:8、1:16等)然后用合适的检测方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增加重组蛋白生产的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物宿主细胞，所述细胞培养基在培养开始之后补充至少一份包含有效量戊酸的补料。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.12 EP 16188411.91.一种增加重组蛋白生产的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物宿主细胞，所述细胞培养基在培养开始之后补充至少一份包含有效量戊酸的补料。2.一种培养表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养所述宿主细胞，所述细胞培养基在培养开始之后补充至少一份包含有效量戊酸的补料。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述重组蛋白选自：抗体或其抗原结合片段，例如人抗体或其抗原结合部分、人源化抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分，重组融合蛋白，生长因子，激素或细胞因子。6.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM·比尔瑟，C·德斯莫格特，
申请(专利权)人：阿雷斯贸易股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH