一种牛结核病刺激上清制备用采血器制造技术

本发明专利技术首先提供一种牛结核病刺激上清制备用采血器，包含有内筒以及采血器常用的其它组件，且在采血器的内筒内放入有肝素和鸡尾酒抗原的混合物，所述的鸡尾酒抗原包括ESAT6、CFP10、FixB和Rv3615c蛋白。本发明专利技术通过对传统方法的简化，仅需采血、孵育后即可直接进行检测。整个试验流程在普通实验室即可进行，每人进行50头牛的刺激上清检测即可节约4小时。使得原本纷繁复杂的牛结核病的γ‑干扰素试验，变得极易普及。同时，本采血器内使用的鸡尾酒抗原可以排除疫苗免疫造成的假阳性反应。

A blood sampler for preparation of bovine tuberculosis stimulating supernatant

The invention first provides a blood sampler for preparing bovine tuberculosis stimulating supernatant, which comprises an inner tube and other components commonly used in the blood sampler, and a mixture of heparin and cocktail antigen is put into the inner tube of the blood sampler. The cocktail antigen includes ESAT6, CFP10, FixB and Rv3615c protein. By simplifying the traditional method, the method can be directly detected after blood collection and incubation. The whole test process can be carried out in the general laboratory, and the stimulation supernatant test of 50 cattle per person can save 4 hours. The interferon gamma test of bovine tuberculosis, which was originally complicated, became very easy to popularize. At the same time, the cocktail antigen used in the blood sampler can eliminate the false positive reaction caused by vaccine immunization.

【技术实现步骤摘要】
一种牛结核病刺激上清制备用采血器
本专利技术属于动物疫病检测设备领域，具体涉及一种牛结核病刺激上清制备用采血器。
技术介绍
牛结核病是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，在我国属二类动物传染病，对养牛业、食品安全与人类健康构成重大威胁。据统计，人结核中约有5％是由牛分枝杆菌引起。因此掌握我国牛结核现状、检疫淘汰感染牛具有重要的公共卫生意义。牛结核病的检疫目前可归为三类，细菌学检测、分子生物学检测和免疫学检测。细菌学检测和分子生物学检测方法的样品采集需要屠宰牛，不适于活畜检疫。免疫学检测方法包括血清学检测和细胞免疫检测，由于分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，因此目前应用最广泛是结核菌素皮内变态反应和牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术，其中牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术已被OIE批准为皮内变态反应的试验的替代试验。常用的牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术的第一步是制备刺激上清。其过程如下：1)采血：用动物用采血器，采集好后将血液打入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温(22±5℃，避免温度过高或过低)下运送到实验室并在采血后8个小时内进行培养；2)加样：将抗凝血加入24孔组织培养板；3)加入刺激抗原，在每孔抗凝血中分别无菌加入牛PPD、禽PPD和PBS(阴性抗原对照)；4)孵育：将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时。5)收样：用移液器小心吸取上层血浆，进行ELISA检测。牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术的第二步是使用ELISA试剂盒检测已收获的刺激上清。可见，目前牛结核病γ干扰素ELISA试验用的刺激上清制备过程繁琐，试剂耗材用量多，工作量很大，再加上收获上清的时间，每人制备50头牛的刺激上清即约耗时5个或更多的小时。同时，ELISA结果判定等均较为复杂，难以在条件不是很完善的实验室推广，且不能够排除疫苗免疫造成的假阳性反应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牛结核病刺激上清制备用采血器，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种牛结核病刺激上清制备用采血器，包含有内筒以及采血器常用的其它组件，且在采血器的内筒内放入有肝素和鸡尾酒抗原的混合物，所述的鸡尾酒抗原包括ESAT6、CFP10、FixB和Rv3615c蛋白，其中ESAT6、CFP10、FixB和Rv3615c抗原蛋白的质量比为2:2:1:1；所述的肝素和鸡尾酒抗原的质量比为1:1。其中肝素和鸡尾酒抗原的混合物是处于干燥状态，例如粉末状态。所述的采血器，还包含有以过渡配合方式安装在内筒1内的活塞2和控制活塞2运动的拉杆3，以及针头4，所述的针头4优选通过采血器帽5安装在内筒1上；所述的采血器帽5是通过螺旋方式安装在内筒1的前端；所述的采血器帽5内还有滤膜6。本专利技术所提供的采血器可用于制备用于牛结核病γ-干扰素检测试剂盒。传统制备方法繁琐复杂，需要将采血、加样、加入刺激抗原、孵育和收样等步骤，需要在条件较好、且配备生物安全柜的高级实验室进行操作，需要耗费细胞培养板等试剂耗材，同时需要耗费大量的时间。而本专利技术通过对传统方法的简化，仅需采血、孵育后即可直接进行检测。整个试验流程在普通实验室即可进行，每人进行50头牛的刺激上清检测即可节约4小时。使得原本纷繁复杂的牛结核病的γ-干扰素试验，变得极易普及。同时，本采血器内使用的鸡尾酒抗原可以排除疫苗免疫造成的假阳性反应。附图说明图1：本专利技术的采血器结构示意图图2：本专利技术的采血器帽的结构示意图；其中1、内筒2、活塞3、拉杆4、针头5、采血器帽6、滤膜；图3：抗原组分筛选图；图4：两种方法制备50头牛花费时间的比较图；图5：两种方法疫苗免疫干扰率的比较图。具体实施方式本专利技术在采血器内放入肝素和筛选获得的鸡尾酒抗原的混合物，可以简化繁琐复杂的刺激上清制备过程，将采血、加样、加入刺激抗原、孵育和收样等简化为采血、孵育后直接进行检测的试验过程。同时节约了细胞培养板等试剂耗材。让必须在条件较好、且配备生物安全柜的高级实验室进行的操作，在普通实验室即可进行，让原本在县级兽医实验室难以进行的牛结核病的γ-干扰素试验，变得极易普及。同时采血器内使用的鸡尾酒抗原还可以排除疫苗免疫造成的假阳性反应。下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。实施例1：采血器的结构本专利技术中，肝素和筛选获得的鸡尾酒抗原的混合物进行干燥后，可以放入常规使用的采血器中；下面对本专利技术所使用的一种采血器进行描述。如图1所示，所述的采血器，还包含有以过渡配合方式安装在内筒1内的活塞2和控制活塞2运动的拉杆3，以及针头4，所述的针头4优选通过采血器帽5安装在内筒1上；所述的采血器帽5是通过螺旋方式安装在内筒1的前端；所述的采血器帽5内还有滤膜6。本实施例的采血器内筒(采血器器体)使用的原料为聚苯乙烯，拉杆、活塞使用的原料为聚丙烯；滤膜6为0.12微米孔径,复合PP+PET材料。所述注射器的一种尺寸如下：器体：长6cm、直径1.7cm拉杆：长8cm活塞：直径1.5采血器帽：直径1.8针头：可使用6号和7号针头。2、肝素锂将肝素锂用灭菌的0.9％生理盐水配制成3mg/mL浓度的溶液，置4℃备用。3、鸡尾酒抗原①抗原组分筛选将ESAT6、CFP10作为必备组分，与将其他各组分进行组合，形成ESAT6/CFP10(简写为EC)、ESAT6/CFP10/MPB83(简写为ECM)、ESAT6/CFP10/FixB(简写为ECF)、ESAT6/CFP10/Rv3615c(简写为ECR)等4种组合，同时以PPDB/PPDA(简写为BA)作用传统方法对照。结果表明ESAT6/CFP10/Rv3615c组合优于其他组合。将ECR与其他分子进行组合，形成ECR、ESAT6/CFP10/Rv3615c/MPB83(ECRM)、ESAT6/CFP10/Rv3615c/FixB(ECRF)、ESAT6/CFP10/Rv3615c/MPB83/FixB(ECRMF)等4种组合，检测结果表明ECRM、ECRF、ECRMF均优于ECR，但ECRM、ECRF、ECRMF之间无明显区别(图3)。但这三种组合中，以ECRF的生产流程最为简单，因此确定以ESAT6/CFP10/Rv3615c/FixB组合作为鸡尾酒抗原组分。②抗原浓度筛选将ESAT6、CFP10、Rv3615c、FixB4种抗原蛋白分别做梯度稀释为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL,烘干后加入3mL抗凝血，进行牛结核病γ-干扰素试验。结果ESAT6、CFP10的最佳使用浓度为80μg/mL，Rv3615c和FixB的最佳使用浓度为40μg/mL。③抗原制备将上述的ESAT6、CFP10、FixB和Rv3615c蛋白，调整为240μg/mL浓度，按照2:2:1:1的比例混合。取100uL鸡尾酒抗原，与50uL稀释好的肝素锂混合。④抗原加样将采血器置于试管架上，针头端朝上，拧开采取器帽，将上述鸡尾酒抗原和肝素锂混合物加入内筒。置湿度25％以下房间的电热恒温干燥箱中，40℃烘干3小时，此时液体消失，偶见白斑遗留在内筒的活塞上面。拧上采血器帽。4.采血器的包装在湿度25％以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛结核病刺激上清制备用采血器，其特征在于，所述的采血器包含有内筒以及采血器常用的其它组件，且在采血器的内筒内放入有肝素和鸡尾酒抗原的混合物，所述的鸡尾酒抗原包括ESAT6、CFP10、FixB和Rv3615c蛋白，其中ESAT6、CFP10、FixB和Rv3615c抗原蛋白的质量比为2:2:1:1。

【技术特征摘要】
1.一种牛结核病刺激上清制备用采血器，其特征在于，所述的采血器包含有内筒以及采血器常用的其它组件，且在采血器的内筒内放入有肝素和鸡尾酒抗原的混合物，所述的鸡尾酒抗原包括ESAT6、CFP10、FixB和Rv3615c蛋白，其中ESAT6、CFP10、FixB和Rv3615c抗原蛋白的质量比为2:2:1:1。2.如权利要求1所述的采血器，其特征在于，所述的肝素和鸡尾酒抗原的质量比为1:1。3.如权利要求1所述的采血器，其特征在于，所述的肝素...

【专利技术属性】
技术研发人员：张喜悦，魏荣，商营利，孙明军，孙翔翔，周晓翠，李阳，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东,37