具有改进的细胞渗透性的肽核酸复合物和包含其的药物组合物制造技术

本发明专利技术涉及一种具有新颖结构的核酸复合物，其可以将生物活性核酸引入细胞中；一种用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和一种使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法；并且更具体地，涉及一种包含生物活性核酸的核酸复合物，该生物活性核酸与被修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补地结合；一种用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和一种使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法。

Peptide nucleic acid complexes with improved cell permeability and pharmaceutical compositions containing them

The present invention relates to a nucleic acid complex with novel structure, which can introduce bioactive nucleic acid into cells; a composition for treating and diagnosing diseases, including the nucleic acid complex; and a method for regulating target gene expression by using the nucleic acid complex; and more specifically, a nucleic acid complex containing bioactive nucleic acid, the bioactive nucleic acid. Acids complementarily bind to carrier peptide nucleic acids modified as overall positive charges; compositions for the treatment and diagnosis of diseases, including the nucleic acid complex; and a method for regulating target gene expression using the nucleic acid complex.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改进的细胞渗透性的肽核酸复合物和包含其的药物组合物
本专利技术涉及具有新颖结构的核酸复合物，其可以将生物活性核酸引入细胞中；用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法；并且更具体地，涉及包含生物活性核酸的核酸复合物，该生物活性核酸与被修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补地结合；用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法。
技术介绍
通常，新药的研究是基于通过计算机研究来筛选多种化合物，并且大多数经筛选的化合物靶向蛋白质。与传统药物不同，核酸药物抑制靶特异性信使RNA(mRNA)的表达，从而有可能解决无法通过靶向蛋白质的常规药物治疗疾病的研究领域(KoleR.等人,NatureRev.DrugDiscov.2012；11；125-140.，WilsonC.等人,Curr.Opin.Chem.Bio.2006；10:607-614.)。尽管基于寡核酸的基因表达调节具有优异的效果和多种应用，但在基于核酸的治疗剂的开发中存在许多需要克服的障碍。例如，寡核酸有被核酸酶等损害的风险，并且由于这些寡核酸的电特性(电荷)和大小，寡核酸通过被动扩散而通过细胞膜是不可能的。为了克服这些问题，已经不断努力通过核酸修饰来确保生物稳定性。对于经修饰的人工核酸，可以在不丧失生物活性的情况下增加它们对靶核酸的亲和力。肽核酸(PNA)(一种经修饰的人工核酸)是一种在其中引入了(2-氨基乙基)-甘氨酸肽骨架的人工核酸，并且具有与RNA和DNA强烈结合的特性，所述RNA和DNA各自具有与其互补的核苷酸序列。特别地，肽核酸对核酸酶具有抗性并且具有高生物稳定性，并且因此已经对基于多种寡核酸的治疗剂进行了研究。然而，肽核酸具有这样的缺点，即它难以引入细胞中，因为它本质上是电中性的(JoergensenM.等人,Oligonucleotides2011,21；29-37.)。由于核酸作为药物的性能和优点，使用核酸的多种临床试验正在进行中。尽管基于核酸的治疗酸的应用越来越多，但载体用于细胞内引入的用途非常有限。例如，已经使用这样的策略(方法)进行临床试验，所述策略(方法)通过使用纳米颗粒、阳离子脂质体和聚合物纳米颗粒将基于寡核酸的药物递送到细胞或组织中。然而，大多数这些临床试验不包括递送系统，并且主要依赖于通过肠胃外给予途径(包括肌内注射、眼内给予、皮下注射等)直接引入核酸。另外，寡核酸本身的细胞膜渗透性相当低，并且特别是DNA或RNA带负电荷。由于这个原因，这些寡核酸不能通过细胞膜的疏水性磷脂双层，并且因此难以通过简单扩散递送到细胞中。使用病毒载体(如逆转录病毒或AAV(腺相关病毒))可以将寡核酸引入细胞中，但是有风险，如非预期的免疫活性和可能的癌基因重组(CoutoL.B.等人,Curr.Opin.Pharmacol.2010,5；534-542.)。由于这个原因，基于具有低细胞毒性和低免疫活性的非病毒寡核酸的核酸载体的开发具有越来越重要的意义。因此，已经开发了使用阳离子脂质、脂质体、稳定核酸脂质颗粒(SNALP)、聚合物和细胞穿透肽引入核酸的技术(ZhiD.等人,Bioconjug.Chem.2013,24；487-519.，BuyensK.等人,J.ControlRelease,2012,158；362-70.，ROSSI,J.J.等人,GeneTher.2006,13:583-584.，YousefiA.等人,J.ControlRelease,2013,170；209-18.，TrabuloS.等人,Curr.Pharm.Des.2013,19；2895-923.)。这些核酸递送技术通过直接结合(包括复合物形成步骤)具有功能部分，并且具有与脂质体结构的内体逃逸效率、体内毒性等相关的问题。因此，需要改进引入寡核酸的功能并克服与生产程序和副作用相关的问题。在这种技术背景下，本专利技术人进行了广泛的努力以开发具有低细胞毒性、允许生物活性核酸渗透到细胞中的能力和增加的调节基因表达的能力的新结构，并且结果发现包含与被修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补地结合的生物活性核酸的核酸复合物具有令人惊讶的增加的细胞渗透性，并且可以使用该核酸复合物非常有效地调节靶基因的表达，从而完成本专利技术。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，并且本专利技术的一个目的在于提供一种核酸复合物，其包含与被修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补地结合的生物活性核酸；一种用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和一种使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于治疗疾病的方法，其包括向需要治疗的患者给予根据本专利技术的核酸复合物和/或包含其的药物组合物。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种具有由以下结构式(1)表示的结构的核酸复合物：[结构式(1)][A≡C(+)]，其中A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸；C表示能够与该生物活性核酸结合的载体肽核酸；“≡”表示该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的互补结合；由A表示的该生物活性核酸总体带负电荷或是中性的；C(+)指示该载体肽核酸总体带正电荷；并且该载体肽核酸包含一个或多个经修饰以使得该载体肽核酸总体带正电荷的肽核酸单体。可以通过适当地控制该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的电荷平衡来控制由结构式(1)表示的该核酸复合物的粒径。具体地，随着该载体肽核酸的正电荷增加，该核酸复合物的粒径变小，但是如果该载体肽核酸的正电荷超过一定水平，则该核酸复合物的粒径变大。另外，该核酸复合物的粒径由随该复合物的生物活性肽核酸的电荷的该生物活性核酸和该载体肽核酸之间的适当电荷平衡来决定。根据本专利技术的载体肽核酸的正电荷数是1至7(指示包括2至5个带正电荷的单体)、优选2至5、最优选2至3，并且用于电荷平衡的该生物活性核酸的净负电荷数是0至5、优选0至3。根据本专利技术的核酸复合物的粒径是5至300nm、优选10至80nm、最优选15至70nm。因此，本专利技术还提供了一种控制由结构式(1)表示的核酸复合物的粒径的方法，其包括控制该核酸复合物的电荷平衡。本专利技术还提供了一种用于预防和治疗疾病的组合物，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物；一种用于诊断疾病的组合物，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物；和一种用于调节靶基因表达的组合物，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物。本专利技术还提供了一种用于诊断疾病的试剂盒，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物。本专利技术还提供了一种使用复合物调节靶基因表达的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过使生物活性核酸与载体肽核酸结合来形成该复合物；并且(b)通过使该复合物与靶细胞接触将该复合物引入该靶细胞中。本专利技术还提供了一种用于治疗疾病的方法，其包括向需要治疗的患者给予根据本专利技术的核酸复合物和/或包含其的药物组合物。附图说明图1显示了单链生物活性核酸与由结构式(1)表示的核酸复合物之间的粒径比较，所述核酸复合物包含与载体肽核酸平行结合的生物活性核酸。(A)：仅生物活性核酸；(B)：核酸复合物，其包含与载体肽核酸平行结合的生物活性肽核酸。图2a和2b是SEM照片，显示了随着由结构式(1)表示的核酸复合物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有由以下结构式(1)表示的结构的核酸复合物：[结构式(1)][A≡C

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.09 KR 10-2016-01013741.一种具有由以下结构式(1)表示的结构的核酸复合物：[结构式(1)][A≡C(+)]，其中A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸；C表示能够与该生物活性核酸结合的载体肽核酸；“≡”表示该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的互补结合；由A表示的该生物活性核酸总体带负电荷或是中性的；C(+)指示该载体肽核酸总体带正电荷；并且该载体肽核酸包含一个或多个经修饰肽核酸单体，使得该载体肽核酸总体带正电荷。2.权利要求1的核酸复合物，其中该生物活性核酸和该载体肽核酸各自包含2至50个核酸单体。3.权利要求1的核酸复合物，其中该生物活性核酸包含选自DNA、RNA、LNA、PNA和经修饰肽核酸的核酸单体。4.权利要求1的核酸复合物，其中该核酸复合物总体带正电荷。5.权利要求1的核酸复合物，其中该载体肽核酸具有与该生物活性核酸部分或完全互补的核苷酸序列。6.权利要求5的核酸复合物，其中具有与该生物活性核酸部分互补的核苷酸序列的该载体肽核酸包含一个或多个通用碱基。7.权利要求1的核酸复合物，其中该载体肽核酸包含一个或多个γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体，以总体带正电荷。8.权利要求7的核酸复合物，其中该γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体在其骨架中包含一个或多个选自赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物的带正电荷的氨基酸，以是电正性的。9.权利要求8的核酸复合物，其中该γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体在骨架中包含一个或多个选自谷氨酸(Glu，E)、天冬氨酸(Asp，D)和氨基酸类似物的带负电荷的氨基酸。10.权利要求8的核酸复合物，其中该γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体包含比具有带负电荷的氨基酸的单体数目更多的具有带正电荷的氨基酸的单体，使得该载体肽核酸总体带正电荷。11.权利要求1的核酸复合物，其中根据每种核酸的5'方向性和3'方向性，该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合是反平行结合或平行结合。12.权利要求1的核酸复合物，其中该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于该生物活性核酸与该生物活性核酸靶向的基因之间的结合亲和力。13.权利要求12的核酸复合物，其中该生物活性核酸和该载体肽核酸通过平行结合或部分特异性结合彼此结合，使得该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于该生物活性核酸与该生物活性核酸靶向的基因之间的结合亲和力。14.权利要求12的核酸复合物，其中该载体肽核酸具有接头、通用碱基和至少一个选自不与该生物活性核酸的相应碱基互补的肽核碱基的肽核碱基，使得该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于该生物活性核酸与该生物活性核酸靶向的基因之间的结合亲和力。15.权利要求12的核酸复合物，其中该生物活性核酸与该载...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵君镐，金惠周，柳之娟，C·巴托奇里，许德会，朴希卿，
申请(专利权)人：海阳制药，
类型：发明
国别省市：韩国,KR