本发明专利技术提供一种基因OsNTL3在改良水稻高温抗性方面的应用及获得的水稻高温抗性基因。基因OsNTL3其碱基序列如SEQIDNO.1所示。本发明专利技术利用高温诱导型启动子过表达去除跨膜域的OsNTL3基因，该转基因水稻材料在高温抗性方面显著增强。所述的高温诱导型启动子为BiP2和BiP4，BiP2的碱基序列如SEQIDNO.4所示，BiP4的碱基序列如SEQIDNO.5所示。水稻高温抗性基因，其碱基序列如SEQIDNO.6所示。水稻高温抗性基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。此转基因水稻材料在苗期的高温抗性方面表现出耐受性状，能够明显提高农作物对高温等胁迫的抗性。
Application of OsNTL3 Gene in Improving High Temperature Resistance of Rice and Obtained High Temperature Resistance Gene of Rice
The invention provides an application of gene OsNTL3 in improving high temperature resistance of rice and a rice high temperature resistance gene obtained. The base sequence of OsNTL3 gene is shown in SEQIDNO.1. The present invention utilizes high temperature inducible promoter overexpression to remove OsNTL3 gene across the membrane domain, and the transgenic rice material significantly enhances high temperature resistance. The high temperature inducible promoters are BiP2 and BiP4. The base sequence of BiP2 is shown in SEQIDNO.4 and that of BiP4 is shown in SEQIDNO.5. The base sequence of high temperature resistance gene in rice is shown in SEQIDNO.6. The amino acid sequence of the protein encoded by the high temperature resistance gene in rice is shown in SEQIDNO.7. The transgenic rice showed tolerance to high temperature stress at seedling stage, which could significantly improve the resistance of crops to high temperature stress.
【技术实现步骤摘要】
基因OsNTL3在改良水稻高温抗性方面的应用及获得的水稻高温抗性基因
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种基因OsNTL3在改良水稻高温抗性方面的应用及获得的水稻高温抗性基因。
技术介绍
高温、干旱、盐碱、冷害、冻害等环境胁迫是世界范围内粮食减产、品质降低的主要原因之一。为此，植物在长期的进化过程中形成了响应各种生物胁迫和非生物胁迫，提高抗性的适应机制和调控网络。植物对环境胁迫的应答过程涉及基因表达的调控，而转录因子是植物响应环境胁迫的主要调节因子，当环境条件发生变化时，植物通过一系列的信号感知和加工过程，激活转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件结合后，启动或抑制下游基因的转录和翻译，最终使植物对内、外界的变化作出相应的调节作用。很多转录因子家族成员都参与植物对非生物环境胁迫的响应，比较大的基因家族有：bZIP、AP2/ERF、NAC、WRKY、MYB、ZincFinger和bHLH等(S.Lindemose,etal.Structure,functionandnetworksoftranscriptionfactorsinvolvedinabioticstressresponses.Int.J.Mol.Sci.14(2013)5842-5878)。大量的研究表明，通过基因工程调控这些参与植物抗逆过程的转录因子的表达，可以显著提高植物对高温、干旱、盐害、低温等非生物胁迫和生物胁迫的抗性，说明对转录因子的调控是植物抵御环境胁迫的关键环节。本课题组利用蛋白错误折叠诱导剂诱导水稻材料进行基因芯片分析时，发现OsNTL3是受衣霉素TM(Tunicamycin，抑制内质网中蛋白的N-糖基化从而造成蛋白折叠错误)和氮杂环丁烷-2羧酸AZC(Azetidine-2-carboxylicacid，一种脯氨酸类似物，可取代脯氨酸整合到蛋白中从而造成蛋白折叠错误)上调表达的水稻膜结合NAC转录因子，由此推测它在水稻响应特定环境胁迫引起蛋白错误折叠的调控途径中起着至关重要的作用。水稻基因组中含有大约140个NAC转录因子，其中一些转录因子的功能也被报道(Y.J.Fang,etal.Systematicsequenceanalysisandidentificationoftissue-specificorstress-responsivegenesofNACtranscriptionfactorfamilyinrice,Mol.Genet.Genomics280(2008)547-563.)。SNAC1和SNAC2能够响应非生物胁迫(H.H.Hu,etal.OverexpressingaNAM,ATAF,andCUC(NAC)transcriptionfactorenhancesdroughtresistanceandsalttoleranceinrice,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103(2006)12987-12992.)。SNAC2参与了植物耐盐的过程。而OsNAC6能够响应许多的生物胁迫和非生物胁迫，过表达OsNAC6的水稻材料表现出明显的耐旱，耐盐的性状(K.Nakashima,etal.FunctionalanalysisofaNAC-typetranscriptionfactorOsNAC6involvedinabioticandbioticstressresponsivegeneexpressioninrice,PlantJ.51(2007)617-630.)。分析NAC转录因子的蛋白结构发现水稻中含有5个膜结合NAC转录因子。膜结合NAC转录因子也称为NTL(NTM1-Like)。拟南芥中的NTL大多受非生物胁迫的诱导，他们参与了植物对非生物胁迫的响应。Chung-MoPark组初步研究水稻膜结合NAC转录因子的表达模式，发现它们与拟南芥NTLs相似，水稻膜结合NAC转录因子大多也可被非生物胁迫诱导，因此我们推测膜结合转录因子的调控是基因调节网络的重要组成部分，在植物应对不良环境过程中发挥着重要作用。
技术实现思路
本专利技术提供一种基因OsNTL3在改良水稻高温抗性方面的应用及获得的水稻高温抗性基因，通过基因手段获得基因组改变的水稻植株。本专利技术利用水稻膜结合NAC转录因子OsNTL3影响水稻高温抗性方面的应用。本专利技术提供的OsNTL3基因是水稻第1号染色体上的一个膜结合NAC转录因子基因，基因编号为Os01g0261200(RAP编号)或LOC_Os01g15640(MSU编号)。本专利技术中使用的启动子序列来自水稻第3号染色体和第5号染色体的BiP2和BiP4基因，基因编码分别为Os03g0710500、Os05g0428600(RAP编号)或LOC_Os03g50250、LOC_Os05g35400(MSU编号)。OsNTL3的基因组DNA全长4718bp，共含有4个外显子，序列如SEQIDNO.1所示，其结构图见图1。OsNTL3基因编码区CDS全长为1470bp，序列如SEQIDNO.2所示；OsNTL3基因编码489个氨基酸，具体序列如SEQIDNO.3所示。OsNTL3蛋白含有一个NAC结构域(NACdomain)，一个跨膜结构域(transmembranedomain)，具体见图2所示。本专利技术提供一种利用OsNTL3基因改变水稻高温性状方面的应用，具体为：设计针对OsNTL3基因的sgRNA，采用CRISPR-CAS9基因组编辑技术，在OsNTL3基因组特定位置造成碱基突变、缺失或插入，从而获得基因组改变的水稻植株；设计针对BiP2和BiP4的启动子DNA的引物序列，针对去除跨膜域OsNTL3基因的引物序列，构建过表达载体，通过农杆菌转化实验获得OSNTL3过表达的转基因材料。BiP2和BiP4启动子DNA全长分别为1642bp和2232bp，序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5。编码去除跨膜域的OsNTL3蛋白(OsNTL3deltaC)的基因序列和蛋白序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7。本专利技术提供设计并合成sgRNA所需的前导序列(GuideSequence)，其序列碱基为：CC-NTL3-F15-GTGTGTATATACAAGCATGAACCA-324mer(SEQIDNO.8)CC-NTL3-F25-GTGTCAGGCTGTTCGGATGCTCGA-324mer(SEQIDNO.9)CC-NTL3-R15-AAACTGGTTCATGCTTGTATATAC-324mer(SEQIDNO.10)CC-NTL3-R25-AAACTCGAGCATCCGAACAGCCTG-324mer(SEQIDNO.11)将CC-NTL3-F1和CC-NTL3-R1，CC-NTL3-F2和CC-NTL3-R2等量混合后，合成双链。具体为：在94℃加热5min，在60℃保持30min。将此合成的双链插入到CRISPR-CAS9载体中。本专利技术提供设计并合成BiP2/4启动子所需的正反向引物序列，其序列碱基为：Pro:BiP2-F5-CCGGAATTCATATTCGGCCTCGTCGCCTCGC-331mer(SEQIDNO.12)Pro:BiP2-R5-CGGG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基因OsNTL3在改良水稻高温抗性方面的应用，其特征在于，基因OsNTL3的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.基因OsNTL3在改良水稻高温抗性方面的应用，其特征在于，基因OsNTL3的碱基序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用高温诱导型启动子过表达去除跨膜域的OsNTL3基因，该转基因水稻材料在高温抗性方面显著增强。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的高温诱导型启动子其中一个为BiP2...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘建祥，刘学欢，陆孙杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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