一种磁性微球及其制备方法以及微生物的检测方法技术

本发明专利技术涉及微生物检测领域，具体而言，涉及一种磁性微球及其制备方法以及微生物的检测方法。一种磁性微球，包括微球本体，所述微球本体携带负电荷；吸附在所述微球本体外表面的携带正电荷的PEI。本发明专利技术提供的磁性微球能有效吸附样品中的微生物，特异性强，吸附较为紧密，降低其他杂质的干扰，通过检测拉曼信号使得不同微生物得以区分，该检测方法大大缩短检测时间，方法便捷可靠，准确率均为96％以上，为临床血液感染的诊断和治疗提供一种新颖、快速的检测方式。

A magnetic microsphere and its preparation method and microbial detection method

The invention relates to the field of microbial detection, in particular to a magnetic microsphere, a preparation method thereof and a microbial detection method. A magnetic microsphere comprises a microsphere body which carries a negative charge and a positive charge PEI adsorbed on the outer surface of the microsphere body. The magnetic microsphere provided by the invention can effectively adsorb microorganisms in the sample, has strong specificity, relatively close adsorption, and reduces the interference of other impurities. By detecting Raman signals, different microorganisms can be distinguished. The detection method greatly shortens the detection time, is convenient and reliable, and the accuracy is more than 96%. It provides a novel method for the diagnosis and treatment of clinical blood infections. Fast detection method.

【技术实现步骤摘要】
一种磁性微球及其制备方法以及微生物的检测方法
本专利技术涉及微生物检测领域，具体而言，涉及一种磁性微球及其制备方法以及微生物的检测方法。
技术介绍
近年来，随着创伤性诊断和治疗技术的大力发展以及广谱抗生素和激素的广泛应用，血流感染的发病率逐年增加。血流感染的死亡率高，发病率高，住院时间长，医疗费用高，危害严重。因此，血流感染的控制受到越来越多的关注。随着各种操作技术的发展和抗菌药物的应用，引起血流感染的病原体不断变化，病原体的耐药性逐渐增加。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(CRPA)、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(CRAB)和其他耐药菌株不断出现。金黄色葡萄球菌，特别是MRSA是引起血流感染的最重要的致病菌之一。在严重的情况下，它可能导致肺炎、感染性心内膜炎、败血症和骨髓炎等致命疾病。随着临床抗菌药物使用的增加，金黄色葡萄球菌的耐药性越来越严重，MRSA的分离率也越来越高。由于临床治疗困难和愈后不良，它引起了全世界的关注。铜绿假单胞菌不仅引起烧伤患者的菌血症，而且是导管相关性尿路感染(UTI)和气管插管患者医院感染的主要原因。它对许多抗生素具有天然抗性，因此被认为是多重耐药病原菌。碳青霉烯类被认为是铜绿假单胞菌感染严重病例治疗的第一道防线，尽管如此，在过去几年中，CRPA一直在增加。鲍曼不动杆菌引起的感染主要发生在呼吸系统，可引起呼吸机相关性肺炎(VAP)、血流感染、皮肤和软组织感染、浸润性导管感染、泌尿生殖系感染、脑膜炎等，并且没有用于预防鲍曼不动杆菌感染的有效的疫苗。因此，临床上预防，治疗和护理感染这些细菌的患者是极其困难的。合理使用抗菌药物是降低血流感染发生率和提高治愈率的关键。因此，我们需要快速可靠的诊断方法来加速血培养中的细菌鉴定和药敏检测，以便及时提供适当的治疗和有效的抗生素管理干预。目前，致病菌的鉴定和药敏试验仍主要依赖于常规血培养。该方法需要很长时间(3到5天)并且需要大量的手工劳动，缺乏有效的检测技术，并且导致临床传染病被遗漏或延误诊断。近年来，随着生物技术的快速发展，聚合酶链反应(PCR)，基因芯片，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)和新一代测序技术得到了探索和应用。在病原菌的细菌鉴定和药敏试验中作为传统检测方法的补充，但仍存在许多限制其使用的问题。PCR鉴定期间发生的假阴性或假阳性以及免疫测定过程中所需的多步化学试剂都限制了它们的应用，这些技术昂贵，耗时和/或表现出低敏感性。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种磁性微球，该磁性微球为微生物的检测提供良好的基础。本专利技术的第二目的在于提供一种所述的磁性微球的制备方法，该方法简便易行，为磁性微球的广泛应用提供良好的基础。本专利技术的第三目的在于提供一种微生物的检测方法，通过检测拉曼信号来判断微生物的种类，大大缩短检测时间。本专利技术的第四目的在于提供一种微生物检测试剂盒，为微生物的检测提供便利。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种磁性微球，包括微球本体，所述微球本体携带负电荷；吸附在所述微球本体外表面的携带正电荷的PEI。PEI是一种阳离子聚合物，具有大量的氨基化物和良好的亲水性，PEI可以在纳米粒子表面粘附或组装，容易实现组装的均一化分布，以实现表面胺化，为微生物的检测提供良好的基础。进一步地，所述微球本体为磁性Fe3O4颗粒。进一步地，所述Fe3O4颗粒的粒径为200±20nm。进一步地，所述PEI的分子量为25±2kDa。本专利技术还提供了磁性微球的制备方法，包括以下步骤：微球本体与PEI在溶剂中超声处理50-70min，洗涤，得到所述磁性微球。进一步地，所述微球本体在溶剂中的浓度为4-6g/L，所述PEI在溶剂中的浓度为4-6g/L。进一步地，所述溶剂为水。进一步地，所述洗涤采用双蒸水进行。表面增强拉曼散射(SERS)检测具有成本低，易于操作，高灵敏度，快速和无损测试的优点，并且需要最少的样品制备。细菌表面复杂，含有多种生物大分子，如蛋白质，脂类，多糖等。通过常用的分析方法难以进行实时，原位和非破坏性测试。SERS光谱的高灵敏度和指纹图谱可以满足快速准确检测病原微生物的要求。早在1989年，霍尔特和棉花首次报道了SERS谱的细菌。四年后，Magee教授指出，使用整个生物体的指纹谱完全可以检测病原体。此后，已经报道了基于SERS检测细菌的新方法，即细菌的指纹，例如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，炭疽芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。虽然有很多关于SERS增强底物的报道直接增强纯培养细菌获得目标细菌的SERS指纹并进行聚类分析，但临床样品中致病菌快速SERS检测的研究仍处于探索阶段。主要困难是临床样品成分复杂，而常见的SERS增强底物缺乏选择性，因此实际样品中杂质的信号会严重干扰目标细菌的SERS信号。此外，在快速药物敏感性领域很少有报道，临床医生特别关注这一问题。鉴于SERS指纹检测病原菌的问题和临床样品中细菌成分的复杂性，该研究计划通过将病原体多重识别系统分为三个步骤来解决这些问题。第一步是检测病原体及其耐药菌株的指纹图谱作为标准光谱。在第二步中，PEI修饰的磁性纳米颗粒用于从临床样品中分离细菌，并且将磁性纳米颗粒/细菌复合物在正常血液平板和抗药性培养板上培养过夜以形成单个菌落。在第三步中，从培养基中选择目标单菌落，并与制备的高性能SERS增强材料混合，然后加入到硅晶片中。将混合物自然风干后，检测拉曼光谱，并将获得的细菌光谱与我们在第一步中测量的标准光谱进行比较，以确定它是否是相应的致病菌。显然，在药物敏感培养板上生长的菌落只能是相应的耐药细菌。将菌落与SERS增强材料(AgNPs)混合以检测光谱并与标准光谱比较以确定病原体是否具有抗性。SERS指纹图谱和药物敏感培养板可以双重确定致病菌及其耐药菌株。本专利技术提供的一种微生物的检测方法，包括以下步骤：上述的磁性微球吸附待检测物，检测拉曼信号，根据拉曼信号的峰值判断待检测物的微生物种类；所述待检测物为含有携带有负电荷的微生物的样品。进一步地，所述待检测物为病原体。进一步地，所述病原体包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中的任一种或多种。进一步地，所述待检测样品为血液样品。即本专利技术提供的磁性微球能有效吸附样品中的微生物，降低其他杂质的干扰。在实际操作中，样品与磁性微球混合孵育一段时间后，通过在试管外磁性吸附，使得携带有微生物的磁性微球与磁体吸附，这样可去除其他杂质，然后根据需要进行洗涤，进一步去除杂质。目前，用于检测患者血液样本的临床实验室程序首先是将血培养瓶放入自动血培养仪进行细菌培养。在细菌增殖至仪器的阳性结果(1-2天)后，取出血培养瓶，然后进行平板菌落培养，并在一天后进行细菌鉴定和药物敏感性检测。整个过程大约需要3-5天。而本专利技术的方法是在接收血培养瓶时将磁性微球如Fe3O4@PEI放入血培养瓶中，捕获并富集血液中的细菌，然后将收集的Fe3O4@PEI@细菌复合物涂在普通平板上和药物敏感板，37℃培养过夜，选择目标致病菌进行拉曼光谱检测，并与之前建立的标准光谱进行比较。通过将光谱与OPLS-DA的化学计量学分析以及普通板和药物敏感板的生长相结合，实现了目标致病菌的鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁性微球，其特征在于，包括微球本体，所述微球本体携带负电荷；吸附在所述微球本体外表面的携带正电荷的PEI；进一步地，所述微球本体为磁性Fe3O4颗粒；进一步地，所述Fe3O4颗粒的粒径为200±20nm；进一步地，所述PEI的分子量为25±2kDa。

【技术特征摘要】
1.一种磁性微球，其特征在于，包括微球本体，所述微球本体携带负电荷；吸附在所述微球本体外表面的携带正电荷的PEI；进一步地，所述微球本体为磁性Fe3O4颗粒；进一步地，所述Fe3O4颗粒的粒径为200±20nm；进一步地，所述PEI的分子量为25±2kDa。2.权利要求1所述的磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：微球本体与PEI在溶剂中超声处理50-70min，洗涤，得到所述磁性微球；进一步地，所述微球本体在溶剂中的浓度为4-6g/L，所述PEI在溶剂中的浓度为4-6g/L；进一步地，所述溶剂为水；进一步地，所述洗涤采用双蒸水进行。3.一种微生物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：权利要求1所述的磁性微球吸附待检测物，检测拉曼信号，根据拉曼信号的峰值判断待检测物的微生物种类；所述待检测物为含有携带有负电荷的微生物的样品。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述待检测物为病原体；进一步地，所述病原体包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中的任一种或多种；进一步地，所述待检测样品为血液样品。5.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖瑞，汪崇文，李佳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11