用于功能分析多特异性分子的基于SPR的双重结合测定法制造技术

本文报道了测定抗体与第一和第二抗原结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成捕获的抗体‑抗原复合物并测定第一结合信号，i)孵育捕获的抗体‑抗原复合物与没用于形成捕获的抗体‑抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体‑抗原‑抗原复合物并测定第二结合信号，或者ii)再生表面，使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与没用于形成步骤b)中捕获的抗体‑抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体‑抗原‑抗原复合物并测定第三结合信号，和测定来自第一结合信号和第二或第三结合信号的抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。

SPR-based double-binding assay for functional analysis of multi-specific molecules

This paper reports a method for determining the binding of antibodies to the first and second antigens. The antibodies contain the first binding site specific to the first antigen and the second binding site specific to the second antigen. With the first or second antigens, to form captured antibody-antigen complexes and determine the first binding signal, i) incubate captured antibody-antigen complexes and antigens not used to form captured antibody-antigen complexes, to form captured antibody-antigen complexes and determine the second binding signal, or ii) regenerated surface, using a specific binding antibody constant structure. Domain capture reagents capture antibodies on solid phase, incubate captured antibodies and antigens not used to form captured antibody antigen complexes in step B to form captured antibody antigen antigen complexes and determine the third binding signal, and determine the total or separate binding of antibodies from the first binding signal and the second or third binding signal to the first and second antigens.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于功能分析多特异性分子的基于SPR的双重结合测定法本专利技术属于功能测定法的领域。本文报道了一种用于测量多特异性抗体相互作用的基于SPR的新型双重结合测定法。可以基于测定的单独读数来计算总体结合。
技术介绍
SPR(表面等离子体共振)是一种基于生物传感器的技术，用于测量实时蛋白质-蛋白质相互作用。SPR技术已成为生物制药研究和开发的标准工具[1-5]，并且通常用于测定大分子相互作用的结合常数。测定分子相互作用的结合和解离动力学的性能提供了对复合物形成机制的详细了解[6]。这些信息正在成为单克隆抗体和其他生物制药产品的选择和优化过程的重要组成部分[7-10]。此外，SPR技术允许测定(例如抗体)结合靶标的结合活性(结合性能)。只有几种技术可用于在一种方法中对两种或更多种相互作用进行功能评估(例如，悬浮阵列技术，在[12]中综述；时间分辨荧光测定法[13])。这些技术利用了不同荧光团的平行检测。此外，还存在光学生物传感器，其允许联机–由此顺序地-测量多种相互作用[2-5]。US2010/256338公开了多特异性抗体，尤其是包含全长抗体和单链Fab片段的双特异性抗体、其制备方法、含有该抗体的药物组合物及其用途。WO2012/023053公开了针对免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体，以及产生针对免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体的方法。WO2015/172800公开了新型多特异性分子和基于这种多特异性分子的新型治疗方法。Meschendoerfer，W等人公开了基于SPR的测定法能够实现双特异性分子的全功能分析(J.Pharm.Biomed.Anal.132(2016)141-147)。
技术实现思路
本文报道了一种用于测量双特异性抗体的两种结合活性的基于SPR的新型双重结合测定法。可以基于测量的两个单独读数来计算总体结合。与标准基于SPR的桥接测定法相比较，显示出良好的相关性。如本文报道的测定法允许双特异性抗体的全功能分析。本文报道的一个方面是用于测定(单克隆)抗体与第一和第二抗原单独结合和总体结合的测定法或方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：a)使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，b)孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成捕获的抗体-抗原复合物并测定第一结合信号，c)孵育捕获的抗体-抗原复合物与没用于形成捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物并测定第二结合信号，或者再生表面，使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与没用于形成步骤b)中捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成第二捕获的抗体-抗原复合物并测定第三结合信号，和d)如果i)捕获的抗体-抗原复合物的形成获得第一结合信号，和ii)捕获的抗体-抗原-抗原复合物的形成、或者再生后(第二)捕获的抗体-抗原复合物的形成获得相对于第一结合信号不同或增加的第二或第三结合信号，则测定抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测定结合信号。在一个实施方案中，固相是表面等离子体共振芯片，第一结合信号是表面等离子体共振反应，第二结合信号是表面等离子体共振反应。在一个实施方案中，第一抗原或/和第二抗原是可溶性抗原。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是CrossMab或DutaFab。在一个实施方案中，捕获试剂是抗Fc区抗体或抗Fab抗体。在一个实施方案中，抗Fab抗体是抗κ轻链抗体或抗λ轻链抗体。在一个实施方案中，抗体是DutaFab，固相是表面等离子体共振芯片，捕获试剂是抗κ轻链抗体或抗λ轻链抗体，第一结合信号是表面等离子体共振反应，第二结合信号是表面等离子体共振反应。在一个实施方案中，通过以2.5至10μL/min的流速和0.6μg/mL至10μg/mL的浓度注射抗体45至720秒进行捕获。在一个实施方案中，通过以约5μL/min的流速和0.6μg/mL至10μg/mL的浓度注射抗体约60秒进行捕获。在一个实施方案中，通过以0.5至5μg/mL的浓度注射相应的抗原20至90秒进行孵育。在一个实施方案中，通过以约2μg/mL的浓度注射相应的抗原30或60秒进行孵育。在一个实施方案中，抗体是DutaFab，固相是表面等离子体共振芯片，捕获试剂是抗κ轻链抗体或抗λ轻链抗体，第一结合信号是表面等离子体共振反应，第二结合信号是表面等离子体共振反应，通过以约5μL/min的流速和0.6μg/mL至10μg/mL的浓度注射抗体约60秒进行固定，并且通过以约2μg/mL的浓度注射相应的抗原30或60秒进行孵育。在一个实施方案中，在包含PBS-T和300mMNaCl的缓冲液中进行孵育。具体实施方式定义术语“约”表示在其后数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示在其后数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示在其后数值的+/-5％的范围。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。抗体通常包含两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。每个重链和轻链多肽含有可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基末端部分)，其包含能够与抗原相互作用的结合区。每个重链和轻链多肽包含恒定区(通常是羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体i)与携带Fcγ受体(FcγR)的细胞(如吞噬细胞)或ii)携带新生儿Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞的结合。其还介导与某些因子的结合，包括经典补体系统的因子，如组分(C1q)。抗体重链的恒定结构域包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，而轻链仅包含一个恒定结构域CL，其可以是κ同种型或λ同种型。免疫球蛋白的轻链或重链的可变结构域又包含不同的区段，即四个框架区(FR)和三个高变区(HVR)。抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。术语“(与抗原)结合”表示在体外测定法中抗体与其抗原的结合，在结合测定法的一个实施方案中，抗体与表面结合并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原与抗体的结合。结合意味着结合性能的度量，例如抗体与靶标A或靶标B、或与捕获分子(例如针对抗体的抗人Fab捕获)的结合性能的度量。如本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即，包含各抗体的群是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然发生突变的变体抗体或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生的变体抗体，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定抗体与第一和第二抗原结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：a)使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，b)孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成捕获的抗体‑抗原复合物并测定第一结合信号，c)孵育捕获的抗体‑抗原复合物与没用于形成捕获的抗体‑抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体‑抗原‑抗原复合物并测定第二结合信号，或者再生表面，使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与没用于形成步骤b)中捕获的抗体‑抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体‑抗原复合物并测定第三结合信号，和d)测定来自第一结合信号和第二或第三结合信号的抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.30 EP 16191712.51.一种测定抗体与第一和第二抗原结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：a)使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，b)孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成捕获的抗体-抗原复合物并测定第一结合信号，c)孵育捕获的抗体-抗原复合物与没用于形成捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物并测定第二结合信号，或者再生表面，使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与没用于形成步骤b)中捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原复合物并测定第三结合信号，和d)测定来自第一结合信号和第二或第三结合信号的抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d)是d)如果i)捕获的抗体-抗原复合物的形成获得第一结合信号，和ii)捕获的抗体-抗原-抗原复合物的形成、或者再生后捕获的抗体-抗原复合物的形成获得相对于第一结合信号增加的第二或第三结合信号，则测定抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。3.一种测定抗体与第一和第二抗原总体和单独结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：-使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，-孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成固定的抗体-抗原复合物，-孵育捕获的抗体-抗原复合物与没用于形成捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物，和-如果捕获的抗体-抗原复合物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·加斯纳，W·梅舍德费尔，J·莫莱肯，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH