从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法、识别个人的方法及分析造血干细胞的植活程度的方法技术

本发明专利技术提供一种通过对100pg以下的人类基因组DNA均匀地进行扩增，判别该100pg以下的人类基因组DNA的来源的方法、识别个人的方法及分析造血干细胞的植活程度的方法。

Methods for identifying the source of human genomic DNA from less than 100 pg, identifying individuals and analyzing the degree of hematopoietic stem cell transplantation

The present invention provides a method for identifying the source of human genomic DNA below 100 pg by homogeneous amplification of human genomic DNA below 100 pg, a method for identifying individuals and a method for analyzing the degree of hematopoietic stem cell transplantation.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法、识别个人的方法及分析造血干细胞的植活程度的方法
本专利技术涉及一种从100pg以下的人类基因组DNA(Deoxyribonucleicacid；脱氧核糖核酸)判别其来源的方法、识别个人的方法及分析造血干细胞的植活(engraftmen)程度的方法。
技术介绍
为了从微量的基因组DNA获取碱基序列信息，需要通过全基因组扩增对成为分析对象的DNA进行扩增之后，通过PCR(PolymeraseChainReaction；聚合酶链反应)对所希望的目标区域进行扩增。但是，该方法中，由于扩增区域的不均匀化或扩增错误等，有时无法获取高精度的碱基序列信息。若不进行全基因组扩增而通过PCR直接对目标区域进行扩增，则能够排除上述的全基因组扩增的影响。但是，由于模板DNA量极少，会产生过度的扩增反应引起的扩增错误或引物彼此的非特异性扩增(引物二聚体)等，有时无法获取准确的碱基序列信息。作为抑制形成引物二聚体的方法，例如，专利文献1中记载有如下内容，即，针对引物的所有组合，计算表示引物之间的3’末端中的互补性的评分(3’末端的局部比对评分)，选出引物彼此的互补性低的引物的组合，由此降低多重PCR中不同目标的引物彼此形成引物二聚体的可能性。以往技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2008/004691号
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题但是，对极微量的模板DNA的多重PCR中，考虑仅在引物端部进行退火而形成的引物二聚体也很重要，但专利文献1中记载的方法并未考虑至此。因此，根据专利文献1中记载的引物的设计方法设计的引物中，对100pg以下的极微量的模板DNA进行多重PCR时，未能对多个目标区域均匀地进行扩增。因此，一直以来，很难从如从遗留DNA或单细胞提取的DNA的100pg以下的微量DNA判别其来源、识别个人及分析造血干细胞的植活程度。因此，本专利技术的课题在于，提供一种通过对100pg以下的人类基因组DNA均匀地进行扩增，判别该100pg以下的人类基因组DNA的来源的方法、识别个人的方法及分析造血干细胞的植活程度的方法。用于解决技术课题的手段本专利技术人等为了解决上述课题而反复进行深入研究，其结果，发现如下内容并完成了本专利技术：在将100pg以下的人类基因组DNA作为模板进行多重PCR时使用的引物的设计方法中，对引物二聚体形成性进行评价，针对引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含引物的碱基序列的3’末端的条件下，进行成对局部比对，从而求出局部比对评分，并根据所求出的局部比对评分进行第1阶段的选拔，针对包含引物候选的碱基序列的3’末端和预先设定的序列长度的碱基序列，进行成对总体比对，从而求出总体比对评分，并根据所求出的总体比对评分进行第2阶段的选拔，若采用在第1阶段及第2阶段的任一阶段中均被选拔的引物，则抑制引物二聚体的形成，能够对多个目标区域均匀地进行扩增。即，本专利技术提供以下的[1]至[6]。[1]一种从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法，其具备：目标区域选择工序，从人类基因组DNA上的区域选择用于获取碱基序列信息的至少1个目标区域；DNA提取工序，从人源试样提取人类基因组DNA；PCR扩增工序，从在上述DNA提取工序中获得的人类基因组DNA，将100pg以下的人类基因组DNA作为模板，利用以对上述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对上述至少1个目标区域进行PCR扩增；DNA测序工序，解读在上述PCR扩增工序中获得的PCR扩增产物的DNA碱基序列，获取上述至少1个目标区域的碱基序列信息；及来源判别工序，根据上述碱基序列信息判别上述人类基因组DNA的来源，上述目标区域选择工序与上述DNA提取工序为任意顺序，上述从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法中，以对上述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合通过用于聚合酶链反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：a)对象区域选择工序，从上述至少1个目标区域选择对象区域；b)引物候选碱基序列制作工序，根据上述人类基因组DNA上的上述对象区域两端的各个附近区域的碱基序列，分别各制作至少1个用于对上述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列；c)局部比对工序，针对从在上述引物候选碱基序列制作工序中制作的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对上述组合中包含的2个碱基序列，在该比较的一部分序列包含上述2个碱基序列的3’末端这样的条件下，进行成对局部比对，从而求出局部比对评分；d)第1阶段选拔工序，根据上述局部比对评分，进行用于对上述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；e)总体比对工序，针对从在上述第1阶段选拔工序中选拔的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对包含上述组合中包含的2个碱基序列的3’末端和预先设定的序列长度的碱基序列，进行成对总体比对，从而求出总体比对评分；f)第2阶段选拔工序，根据上述总体比对评分，进行用于对上述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及g)引物采用工序，采用在上述第1阶段选拔工序及上述第2阶段选拔工序二者中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于对上述对象区域进行PCR扩增的引物的碱基序列，上述局部比对工序及上述第1阶段选拔工序这两个工序和上述总体比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序为任意顺序或同时进行。[2]一种从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法，其具备：目标区域选择工序，从人类基因组DNA上的区域选择用于获取碱基序列信息的至少1个目标区域；DNA提取工序，从人源试样提取人类基因组DNA；PCR扩增工序，从在上述DNA提取工序中获得的人类基因组DNA，将100pg以下的人类基因组DNA作为模板，利用以对上述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对上述至少1个目标区域进行PCR扩增；DNA测序工序，解读在上述PCR扩增工序中获得的PCR扩增产物的DNA碱基序列，获取上述至少1个目标区域的碱基序列信息；及来源判别工序，根据上述碱基序列信息判别上述人类基因组DNA的来源，上述目标区域选择工序和上述DNA提取工序为任意顺序，上述从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法中，以对上述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合通过用于聚合酶链反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：a1)对象区域选择第1工序，从上述至少1个目标区域选择第1对象区域；b1)引物候选碱基序列制作第1工序，根据上述人类基因组DNA上的上述第1对象区域的两端的各个附近区域的碱基序列，分别各制作至少1个用于对上述第1对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列；c1)局部比对第1工序，针对从在上述引物候选碱基序列制作第1工序中制作的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对上述组合中包含的2个碱基序列，在该比较的一部分序列包含上述2个碱基序列的3’末端的条件下，进行成对局部比对，从而求出局部比对评分；d1)第1阶段选拔第1工序，根据上述局部比对评分，进行用于对上述第1对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；e1)总体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法，其具备：目标区域选择工序，从人类基因组DNA上的区域选择用于获取碱基序列信息的至少1个目标区域；DNA提取工序，从人源试样提取人类基因组DNA；PCR扩增工序，从在所述DNA提取工序中获得的人类基因组DNA，将100pg以下的人类基因组DNA作为模板，利用以对所述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对所述至少1个目标区域进行PCR扩增；DNA测序工序，解读在所述PCR扩增工序中获得的PCR扩增产物的DNA碱基序列，获取所述至少1个目标区域的碱基序列信息；及来源判别工序，根据所述碱基序列信息判别所述人类基因组DNA的来源，所述目标区域选择工序与所述DNA提取工序为任意顺序，所述从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法中，以对所述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合通过用于聚合酶链反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：a)对象区域选择工序，从所述至少1个目标区域选择对象区域；b)引物候选碱基序列制作工序，根据所述人类基因组DNA上的所述对象区域两端的各个附近区域的碱基序列，分别各制作至少1个用于对所述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列；c)局部比对工序，针对从在所述引物候选碱基序列制作工序中制作的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对所述组合中包含的2个碱基序列，在该比较的一部分序列包含所述2个碱基序列的3’末端这样的条件下，进行成对局部比对，从而求出局部比对评分；d)第1阶段选拔工序，根据所述局部比对评分，进行用于对所述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；e)总体比对工序，针对从在所述第1阶段选拔工序中选拔的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对包含所述组合中包含的2个碱基序列的3’末端和预先设定的序列长度的碱基序列，进行成对总体比对，从而求出总体比对评分；f)第2阶段选拔工序，根据所述总体比对评分，进行用于对所述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及g)引物采用工序，采用在所述第1阶段选拔工序及所述第2阶段选拔工序二者中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于对所述对象区域进行PCR扩增的引物的碱基序列，所述局部比对工序及所述第1阶段选拔工序这两个工序和所述总体比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序为任意顺序或同时进行。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.30 JP 2016-1939581.一种从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法，其具备：目标区域选择工序，从人类基因组DNA上的区域选择用于获取碱基序列信息的至少1个目标区域；DNA提取工序，从人源试样提取人类基因组DNA；PCR扩增工序，从在所述DNA提取工序中获得的人类基因组DNA，将100pg以下的人类基因组DNA作为模板，利用以对所述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对所述至少1个目标区域进行PCR扩增；DNA测序工序，解读在所述PCR扩增工序中获得的PCR扩增产物的DNA碱基序列，获取所述至少1个目标区域的碱基序列信息；及来源判别工序，根据所述碱基序列信息判别所述人类基因组DNA的来源，所述目标区域选择工序与所述DNA提取工序为任意顺序，所述从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法中，以对所述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合通过用于聚合酶链反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：a)对象区域选择工序，从所述至少1个目标区域选择对象区域；b)引物候选碱基序列制作工序，根据所述人类基因组DNA上的所述对象区域两端的各个附近区域的碱基序列，分别各制作至少1个用于对所述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列；c)局部比对工序，针对从在所述引物候选碱基序列制作工序中制作的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对所述组合中包含的2个碱基序列，在该比较的一部分序列包含所述2个碱基序列的3’末端这样的条件下，进行成对局部比对，从而求出局部比对评分；d)第1阶段选拔工序，根据所述局部比对评分，进行用于对所述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；e)总体比对工序，针对从在所述第1阶段选拔工序中选拔的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对包含所述组合中包含的2个碱基序列的3’末端和预先设定的序列长度的碱基序列，进行成对总体比对，从而求出总体比对评分；f)第2阶段选拔工序，根据所述总体比对评分，进行用于对所述对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及g)引物采用工序，采用在所述第1阶段选拔工序及所述第2阶段选拔工序二者中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于对所述对象区域进行PCR扩增的引物的碱基序列，所述局部比对工序及所述第1阶段选拔工序这两个工序和所述总体比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序为任意顺序或同时进行。2.一种从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法，其具备：目标区域选择工序，从人类基因组DNA上的区域选择用于获取碱基序列信息的至少1个目标区域；DNA提取工序，从人源试样提取人类基因组DNA；PCR扩增工序，从在所述DNA提取工序中获得的人类基因组DNA，将100pg以下的人类基因组DNA作为模板，利用以对所述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对所述至少1个目标区域进行PCR扩增；DNA测序工序，解读在所述PCR扩增工序中获得的PCR扩增产物的DNA碱基序列，获取所述至少1个目标区域的碱基序列信息；及来源判别工序，根据所述碱基序列信息判别所述人类基因组DNA的来源，所述目标区域选择工序和所述DNA提取工序为任意顺序，所述从100pg以下的人类基因组DNA判别其来源的方法中，以对所述至少1个目标区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合通过用于聚合酶链反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：a1)对象区域选择第1工序，从所述至少1个目标区域选择第1对象区域；b1)引物候选碱基序列制作第1工序，根据所述人类基因组DNA上的所述第1对象区域的两端的各个附近区域的碱基序列，分别各制作至少1个用于对所述第1对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列；c1)局部比对第1工序，针对从在所述引物候选碱基序列制作第1工序中制作的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对所述组合中包含的2个碱基序列，在该比较的一部分序列包含所述2个碱基序列的3’末端的条件下，进行成对局部比对，从而求出局部比对评分；d1)第1阶段选拔第1工序，根据所述局部比对评分，进行用于对所述第1对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；e1)总体比对第1工序，针对从在所述第1阶段选拔第1工序中选拔的引物候选的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的所有组合，对包含所述组合中包含的2个碱基序列的3’末端和预先设定的序列长度的碱基序列，进行成对总体比对，从而求出总体比对评分；f1)第2阶段选拔第1工序，根据所述总体比对评分，进行用于对所述第1对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；g1)引物采用第1工序，采用在所述第1阶段选拔第1工序及所述第2阶段选拔第1工序二者中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于对所述第1对象区域进行PCR扩增的引物的碱基序列；a2)对象区域选择第2工序，从所述至少1个目标区域中还未被选择的目标区域选择第2对象区域；b2)引物候选碱基序列制作第2工序，根据所述人类基因组DNA上的所述第2对象区域的两端的各个附近区域的碱基序列，分别各制作至少1个用于对所述第2对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列；c2)局部比对第2工序，针对从在所述引物候选碱基序列制作第2工序中制作的引物候选的碱基序列及已被采用的引物的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的组合和选择1个引物候选的碱基序列及1个已被采用的引物的碱基序列的组合的所有组合，对所述组合中包含的2个碱基序列，在该比较的一部分序列包含所述2个碱基序列的3’末端的条件下，进行成对局部比对，从而求出局部比对评分；d2)第1阶段选拔第2工序，根据所述局部比对评分，进行用于对所述第2对象区域进行PCR扩增的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；e2)总体比对第2工序，针对从在所述第1阶段选拔第2工序中选拔的引物候选的碱基序列及已被采用的引物的碱基序列选择2个引物候选的碱基序列的组合和选择1个引物候选的碱基序列及1个已被采用的引物的碱基序列的组合的所有组合，对包含所述组合中包...

【专利技术属性】
技术研发人员：井上雄喜，辻本尧之，中谷俊幸，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP