小麦常规品种纯度的SSR分子标记检测方法、引物组合及其应用技术

本发明专利技术属于农业生物技术领域，具体涉及用于小麦常规品种纯度的SSR分子标记检测方法、引物组合及其应用。本发明专利技术以审定小麦品种为材料，筛选适于区分无限扩大的审定小麦品种的SSR引物，以荧光毛细管电泳为主要检测平台，建立了规模化、高通量、快速、准确的小麦品种纯度SSR分子标记检测技术。

Detection of Purity of Conventional Wheat Varieties by SSR Molecular Markers, Primer Combination and Its Application

The invention belongs to the field of agricultural biotechnology, in particular to SSR molecular marker detection method for purity of conventional wheat varieties, primer combination and application. The present invention uses certified wheat varieties as materials, screens SSR primers suitable for distinguishing indefinitely expanded certified wheat varieties, takes fluorescence capillary electrophoresis as the main detection platform, and establishes a large-scale, high-throughput, fast and accurate SSR molecular marker detection technology for purity of wheat varieties.

【技术实现步骤摘要】
小麦常规品种纯度的SSR分子标记检测方法、引物组合及其应用
本专利技术属于农业生物
，具体涉及小麦常规品种纯度的SSR分子标记检测方法、引物组合及其应用。
技术介绍
随着我国种植业粮食结构的调整和市场经济的发展，小麦精播用种量显著降低，生产上对种子质量和品种纯度提出了更高的要求。品种纯度是衡量种子质量的重要指标之一，现有的鉴定方法为田间小区种植鉴定、形态鉴定、生化法及醇溶蛋白法。田间种植鉴定占地面积大，费时费工，易受环境因素的影响，难以区别表型相近的个体。醇溶蛋白法具有速度快、费用低、操作简单等优点，但是醇溶蛋白仅由6个基因位点编码，基因位点少，对于分子量相近的组分难以分离，表达量低的醇溶蛋白不易识别等因素均降低了检测结果的准确性。随着小麦基因组学和全基因组测序技术的迅猛发展，大量SSR(SimpleSequenceRepeat,简单序列重复)标记被开发和利用。SSR标记因具有标记数量丰富、共显性遗传、不受鉴定周期和环境的影响、准确可靠、简单快速、成本低廉、稳定性好、易于自动化等优点。但是，SSR标记数量巨大，GrainGenes网站和日本小麦图谱网公布的SSR标记达2760余个，除此之外，其他学者发表的论文及研究成果中也公开了很多SSR标记。我国育成小麦品种由于过度使用部分骨干小麦种质，造成育成小麦品种的同质化严重，遗传基础相对比较狭窄，大部分SSR标记在育成小麦品种中没有多态性或多态性较低。目前市场上高通量SSR基因分型平台的区分能力多在1bp以上，导致小麦中占比近50％的1bp基序SSR标记无法在品种鉴定中使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供小麦常规品种纯度的SSR分子标记检测方法。本专利技术的再一目的在于提供检测小麦常规品种纯度用的SSR分子标记引物组合本专利技术的再一目的在于提供SSR标记引物在小麦常规品种纯度检测中的应用。根据本专利技术具体实施方式，用于常规小麦品种纯度鉴定的10对SSR引物组合的引物名称、SSR分子标记所在的染色体定位信息、等位变异扩增区间、引物序列及标记分组见表1：表1品种纯度鉴定的SSR引物组合标记荧光颜色相同的引物需要同时标记同一种荧光染料，标记的染料颜色可以根据所用毛细管电泳系统型号的发射和吸收波长选择。根据本专利技术具体实施方式的小麦常规品种纯度的SSR分子标记检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待测小麦品种的个体DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板、使用表1所示SSR分子标记引物对进行PCR扩增；(3)毛细管电泳检测；(4)根据步骤(3)的电泳结果，判断待测小麦品种的纯度。根据本专利技术具体实施方式的小麦常规品种纯度的SSR分子标记检测方法，步骤(4)中，首先判断变异位点是否为非纯合的SSR分子标记位点，将非纯合SSR分子标记位点排除后，若某一待测小麦个体中存在至少2个不同于其他多数待测个体的SSR分子标记位点，则判定所述待测小麦个体为杂株。根据本专利技术具体实施方式的小麦常规品种纯度的SSR分子标记检测方法，步骤(4)中，当不同的待测小麦个体的同一个位点上携带两种等位变异或两种等位变异的杂合子，且随机分布在不同待测小麦个体中时，则判定所述位点为非纯合SSR分子标记位点。本专利技术的有益效果：本专利技术的10个SSR标记及对应的引物组合在育成小麦品种中鉴定中具有如下特点：1、每个SSR位点的等位变异的丰富度高，10个SSR标记在我国1463份审定小麦品种中共检出141个等位变异，平均每个位点检测到14.1个等位变异，每个标记的平均PIC值为0.69，对小麦品种具有较高的分辨率；2、在育成小麦品种中每个位点的等位变异分布频率相对均匀；3、具有定位信息且单位点、单拷贝；4、10个SSR标记及其引物组合均能特异性扩增且带型简单易于毛细管峰值读取；5、筛选SSR标记位点的基序在2bp以上；6、一次性电泳的10个SSR标记，标记同一荧光染料引物扩增的所有等位变异的片选区间没有跨叠区且相差15bp以上；7、筛选的10个SSR标记是将我国所有目前已知品种进行基因分型后才最终确定；8、10个SSR标记具备很好的稳定性、重复性，便于推广应用；9、10个SSR标记之间无联锁关系；10、应用本专利技术的SSR标记及引物组合在室内实验室3天即可完成品种纯度的鉴定，大幅度节约人力、物力、财力、时间和土地资源成本。附图说明图1显示非纯合位点的分布特征，其中，1-20泳道是A1202-32样品的个体编号；图2显示杂株的带型特征，1-10号为苏徐2号的10个个体，1号个体为杂株；图3显示偏单亲型非纯合SSR位点(Xgwm294)的特点；图4显示10对SSR引物组合电泳结果，图4-1为barc164电泳峰值图，图4-2为barc324电泳峰值图，图4-3为barc80电泳峰值图，图4-4为cfa2028电泳峰值图，图4-5为gwm161电泳峰值图。图4-6为cfa2123电泳峰值图，图4-7为gwm610电泳峰值图，图4-8为gwm304电泳峰值图，图4-9为gwm155电泳峰值图，如4-10为gwm294电泳峰值图；具体实施方式实施例11.确定本专利技术的分子标记本专利技术最终确定的常规小麦品种纯度鉴定的SSR分子标记如表2所示。表2品种纯度鉴定的SSR引物多态性信息本专利技术筛选的引物有barc80，为3bp基序，在1463份已知品种中有9个等位变异，PIC值为0.61；barc324为3bp基序，在1463份已知品种中有13个等位变异，PIC值为0.66；barc164为3bp基序，在1463份已知品种中有15个等位变异，PIC值为0.77；cfa2028为2bp基序，在1463份已知品种中有7个等位变异，PIC值为0.63；gwm161为2bp基序，在1463份已知品种中有17个等位变异，PIC值为0.65；gwm610为2bp基序，在1463份已知品种中有7个等位变异，PIC值为0.60；cfa2123为2bp基序，在1463份已知品种中有19个等位变异，PIC值为0.71；gwm294为2bp基序，在1463份已知品种中有24个等位变异，PIC值为0.72；gwm155为2bp基序，在1463份已知品种中有12个等位变异，PIC值为0.75；gwm304为2bp基序，在1463份已知品种中有18个等位变异，PIC值为0.76。2.非典型株(杂株)和非纯合SSR位点的正确区分非纯合SSR位点的特点是不同个体的同一个位点分别携带两种等位变异或两种等位变异的杂合子，且其在不同个体的分布是随机的，如图1所示，淮麦23的20个个体在Xcwm65位点上分别携带来自父母本的基因型或父母本的杂合基因型(14号个体)。杂株基因型的特点是同一个个体在2个以上不同的位点上携带的等位变异与正常个体不同，以参加区域试验的品系A1203-32的10个个体为例，如图2所示，1号个体在Xgwm155、Xgwm610、Xgwm294、Xgwm437位点上的基因型与2-9号个体的基因型均不同，因此1号个体为杂株。如图3所示，样品1农大211和样品2洛旱7号的多数个体在位点Xgwm294上等位变异一致，仅样品1的25和31号、样品2的28和34号个体与多数个体等位变异不同，对这些个体又增加了29个位点检测后，确定其差异是因为偏分离等因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测小麦常规品种纯度用的SSR分子标记引物组合，其特征在于，所述引物组合由以下10对引物组成：barc80‑F:GCGAATTAGCATCTGCATCTGTTTGAG，barc80‑R:CGGTCAACCAACTACTGCACAAC；barc324‑F:CCAATTCTGCCCATAGGTGA，barc324‑R:GAGGAAATAAGATTCAGCCAACTG；barc164‑F:TGCAAACTAATCACCAGCGTAA，barc164‑R:CGCTTTCTAAAACTGTTCGGGATTTCTAA；cfa2028‑F:TGGGTATGAAAGGCTGAAGG，cfa2028‑R:ATCGCGACTATTCAACGCTT；gwm161‑F:GATCGAGTGATGGCAGATGG，gwm161‑R:TGTGAATTACTTGGACGTGG；gwm610‑F:CTGCCTTCTCCATGGTTTGT，gwm610‑R:AATGGCCAAAGGTTATGAAGG；cfa2123‑F:CGGTCTTTGTTTGCTCTAAACC，cfa2123‑R:ACCGGCCATCTATGATGAAG；gwm294‑F:GGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG，gwm294‑R:GCAGAGTGATCAATGCCAGA；gwm155‑F:CAATCATTTCCCCCTCCC，gwm155‑R:AATCATTGGAAATCCATATGCC；gwm304‑F:AGGAAACAGAAATATCGCGG，gwm304‑R:AGGACTGTGGGGAATGAATG。...

【技术特征摘要】
1.检测小麦常规品种纯度用的SSR分子标记引物组合，其特征在于，所述引物组合由以下10对引物组成：barc80-F:GCGAATTAGCATCTGCATCTGTTTGAG，barc80-R:CGGTCAACCAACTACTGCACAAC；barc324-F:CCAATTCTGCCCATAGGTGA，barc324-R:GAGGAAATAAGATTCAGCCAACTG；barc164-F:TGCAAACTAATCACCAGCGTAA，barc164-R:CGCTTTCTAAAACTGTTCGGGATTTCTAA；cfa2028-F:TGGGTATGAAAGGCTGAAGG，cfa2028-R:ATCGCGACTATTCAACGCTT；gwm161-F:GATCGAGTGATGGCAGATGG，gwm161-R:TGTGAATTACTTGGACGTGG；gwm610-F:CTGCCTTCTCCATGGTTTGT，gwm610-R:AATGGCCAAAGGTTATGAAGG；cfa2123-F:CGGTCTTTGTTTGCTCTAAACC，cfa2123-R:ACCGGCCATCTATGATGAAG；gwm294-F:GGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG，gwm294-R:GCAGAGTGATCAATGCCAGA；gwm155-F:CAATCATTTCCCCCTCCC，gwm155-R:AATCATTGGAAATCCATATGCC；gwm304-F:AG...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞斌双，刘丽华，赵昌平，刘阳娜，张风廷，李宏博，张立平，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11