植物作为宿主在表达HIV中和抗体中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达HIV广谱中和抗体的应用。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达HIV广谱中和抗体。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用WesternBlot蛋白杂交法确定HIV广谱中和抗体成功表达，对HIV毒株SF162的中和活性测试表明利用生菜生产的HIV抗体具有中和HIV的生物活性。

Application of plants as hosts in the expression of HIV neutralizing antibodies

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the application of plants as hosts to express broad-spectrum neutralizing antibodies against HIV. The invention utilizes plants such as lettuce as an effective expression platform for recombinant protein production, and uses simple and effective Agrobacterium-mediated vacuum osmosis method to express HIV broad-spectrum neutralizing antibodies. The expression system confirmed that plant exogenous proteins could be collected after 4 days of infection by Agrobacterium tumefaciens. Western Blot hybridization was used to determine the successful expression of broad-spectrum neutralizing antibody against HIV. The neutralizing activity test of SF162 showed that the HIV antibody produced by lettuce had the biological activity of neutralizing HIV.

【技术实现步骤摘要】
植物作为宿主在表达HIV中和抗体中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物作为宿主在表达HIV中和抗体中的应用。
技术介绍
艾滋病病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)的传播是全球关注的主要公共健康问题之一。目前全球HIV感染者约有3500万人，每年新增感染者约为200万人。尽管高效抗反转录病毒治疗(Highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)可以有效抑制HIV复制，近20年成功地用于临床治疗，但是仍无法彻底清除感染者体内的病毒，而且长期服药提高了耐药株产生的概率。为了进一步降低全球新发感染率，清除储藏库病毒，亟待寻找更加有效的HIV防治方法。HIV-1广谱中和抗体(Broadlyneutralizingantibodies)在预防感染和补充现有治疗方案中均显现出重要作用，在体外实验中，HIV-1广谱中和抗体可以阻断病毒在细胞间的传播。2018年3月7日，FDA批准创新药物ibalizumab-uiyk/TMB-355(商品名Trogarzo)上市，作为一种全新的抗逆转录病毒疗法，Trogarzo用于治疗现有多种疗法均无法起效的成人艾滋病病毒(HIV)感染者。使用用方法是，患者每14天静脉内注射一次，也可与其他同类药物联合使用。Trogarzo(ibalizumab-uiyk)是一种静脉滴注的人源化免疫球蛋白G4单克隆抗体，它与CD4+T细胞受体的第二个胞外区域结合，阻止HIV病毒入侵这些细胞，和PRO140类似都是一种“病毒侵入抑制剂”。Trogarzo是10多年来首款具有全新作用机制的抗逆转录病毒疗法，ibalizumab曾获得美国FDA颁发的快速通道资格(FastTrack)、优先审评资格(PriorityReview)、突破性疗法认定(BreakthroughTherapydesignations)、以及孤儿药资格(OrphanDrug)。Trogarzo的安全性与疗效在一项临床试验中已得到了验证。该试验招募了40名感染有多重耐药性HIV的患者，他们均重度经治，有些患者甚至已经接受过10种或更多的抗逆转录病毒疗法。然而，研究人员发现，患者即便接受了大量治疗，他们血液中的病毒水平(HIV-RNA)依旧很高。但在原有疗法中，加入Trogarzo的治疗一周后，大部分患者血液中的HIV-RNA水平就有显著下降。24周后，43％的患者其HIV-RNA水平得到了抑制。植物瞬时表达技术是在植物生长到一定阶段，利用多种不同的技术方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物细胞中，在植物细胞中建立高效、可控的表达系统，获得该基因短暂的可控表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到宿主植物染色体中，仅需几天的时间就可拿到实验结果。与细菌表达系统相比，植物表达系统可以对所表达的蛋白进行正确的折叠、加工、修饰，所生产的蛋白活性高于细菌表达系统；与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了植物作为宿主在表达HIV中和抗体Ibalizumab中的应用。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了HIV中和抗体Ibalizumab。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产Ibalizumab抗体蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了植物作为宿主在表达Ibalizumab抗体中的应用。优选的，所述抗体为单克隆抗体。所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本专利技术还提供了一种表达载体，包括Ibalizumab的重链序列或轻链序列以及载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述Ibalizumab的重链序列或轻链序列为将Ibalizumab重链、Ibalizumab轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的Ibalizumab的重链序列或优化的Ibalizumab的轻链序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述优化的Ibalizumab的重链序列如SEQIDNo.2所示；所述优化的Ibalizumab的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的Ibalizumab的轻链序列如SEQIDNo.4所示；所述优化的Ibalizumab的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：步骤1：分别将Ibalizumab重链、Ibalizumab轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：ⅰ.优化的Ibalizumab的重链序列；ⅱ.优化的Ibalizumab的轻链序列；步骤2：在所述优化的Ibalizumab的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点；在所述优化的Ibalizumab的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入SacI位点；由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pIbali-H，pIbali-L克隆载体；步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Ibali-H，p35S-Ibali-L。具体的，为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本专利技术将人Ibalizumab重链以及轻链氨基酸序列利用反翻译软件得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的Ibalizumab重链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl位点。在Ibalizumab轻链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pIbali-H，pIbali-L克隆载体(图1)。基因片段通过XbaI/Sacl分别从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生植物表达载体p35S-Ibali-H，p35S-Ibali-L(图2)。本专利技术还提供了所述的表达载体在表达Ibalizumab抗体中的应用。此外，本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达Ibalizumab抗体的方法，将本专利技术提供的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得Ibalizumab抗体。具体的，将两种植物表达载体p35S-Ibali-H，p35S-Ibali-L分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5LYEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/LMgSO4，p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物作为宿主在表达HIV中和抗体中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

【技术特征摘要】
1.植物作为宿主在表达HIV中和抗体中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。2.一种表达载体，其特征在于，包括HIV中和抗体的重链序列或轻链序列以及载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述HIV中和抗体的重链序列或轻链序列为将HIV中和抗体的重链、HIV中和抗体的轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化HIV中和抗体的重链序列或优化的HIV中和抗体轻链序列。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化的HIV中和抗体的重链序列如SEQIDNo.2所示；所述优化的HIV中和抗体的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的HIV中和抗体的轻链序列如SEQIDNo.4所示；所述优化的HIV中和抗体的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。5.根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。6.根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：分别将HIV中和抗体重链、HIV中和抗体轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：ⅰ.优化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，
申请(专利权)人：王跃驹，
类型：发明
国别省市：美国,US