一种脐带血再生粒子及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种脐带血再生粒子及其制备方法与应用，制备方法步骤是：S1、取脐带血进行离心分层；S2、取一级下层沉淀加入无菌缓冲液再进行离心分层；S3、取二级下层沉淀，加入无菌红细胞裂解液进行离心分层；S4、取三级下层沉淀，加入无菌缓冲液进行离心分层；S5、分别取一级上层溶液、二级上层溶液、四级上层溶液，进行离心分层，离心分层后，收集所有沉淀，加入pH值7.0‑7.4、含有血清的培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，每2‑3天更换培养基一次；S6、经培养处理，检测合格后，收集所有培养成分，离心收集脐带血再生粒子。本发明专利技术的脐带血再生粒子可以在组织细胞再生与修复中进行应用。

A kind of cord blood regeneration particle and its preparation method and Application

The invention discloses a cord blood regeneration particle and its preparation method and application. The preparation method steps are as follows: S1, taking cord blood for centrifugal stratification; S2, taking first-level lower layer precipitation and adding sterile buffer solution for centrifugal stratification; S3, taking second-level lower layer precipitation and adding sterile erythrocyte lysate for centrifugal stratification; S4, taking third-level lower layer precipitation and adding sterile buffer solution for separation. Heart stratification: S5. Take the first, second and fourth upper solution separately for centrifugal stratification. After centrifugal stratification, collect all sediments, add pH 7.0 7.4 and serum-containing medium, and culture them in 37 C and 5% CO 2 incubator. Change the medium every 2 3 days. S6. After culture treatment, collect all the cultures to become qualified. Cord blood regenerated particles were collected by centrifugation. The cord blood regeneration particle of the invention can be applied in tissue cell regeneration and repair.

【技术实现步骤摘要】
一种脐带血再生粒子及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及再生医学、疾病治疗和药物用途等，特别涉及一种脐带血再生粒子及其制备方法与应用。
技术介绍
损伤组织器官的再生与修复，其最终目标是通过再生组织细胞，实现器官功能来达到治愈疾病的目标，再生出来的组织器官需要与个体可以长期共存，因此，对于损伤组织器官再生研究中的核心挑战是开发其能够重构损伤组织器官的细胞并能长期实现其功能的再生组合物。目前用于损伤组织的再生与修复的方法主要有组织器官移植和干细胞治疗技术。组织器官移植虽可以替换受损或患病的组织，但是受制于供体器官来源有限和移植排斥等。干细胞治疗技术前景光明，但存在的安全性风险尚待解决：异常的免疫反应(异源细胞的免疫排斥以及异常炎症反应)；异常增生和促瘤、致瘤性：即便是已在多国获批的骨髓间充质干细胞也具有危险的致瘤性，研究表明过量使用成体间充质干细胞具有很大致瘤风险，可促进癌症生长转移；异常的分化行为：非目标细胞分化、分化紊乱导致的增生性疾病和肿瘤，或细胞无效、低效分化及提前老化导致的器官修复不全或器官衰竭等退行性疾病；对于基因修饰的干细胞，存在导致基因突变和基因组疾病的风险。相关安全性问题的解决尚有赖技术进步和研究深入。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点和不足，本专利技术的首要目的是旨在提供一种脐带血再生粒子的制备方法；第二目的是旨在通过上述制备方法得到脐带血再生粒子；第三目的是提供一种所述脐带血再生粒子在组织细胞再生与修复中的应用。本专利技术的目的是采用如下的技术方案来实现的：一种脐带血再生粒子的制备方法，包含以下步骤：(1)取脐带血进行离心，离心后分为一级上层溶液和一级下层沉淀；(2)取一级下层沉淀，加入无菌缓冲液，进行离心，离心后分为二级上层溶液和二级下层沉淀；(3)取二级下层沉淀，加入无菌红细胞裂解液，置于水平摇床摇动，待完全裂解后进行离心，离心后分为三级上层溶液和三级下层沉淀，三级上层溶液直接弃掉。(4)取三级下层沉淀，加入无菌缓冲液，剧烈晃动，之后进行离心，离心后分为四级上层溶液和四级下层沉淀，四级下层沉淀直接弃掉。(5)分别取一级上层溶液、二级上层溶液、四级上层溶液，进行离心，离心后，收集所有沉淀，加入pH值7.0-7.4、含有血清的培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，每2-3天更换培养基一次。(6)经培养处理，检测合格后，收集所有培养成分，离心收集脐带血再生粒子。以上所有步骤均在无菌环境下进行操作。步骤(1)中所述的脐带血必须是新鲜、无菌、无病原体的。步骤(1)、(2)中所述的离心，优选的离心力为30g-1000g。步骤(2)、(4)中所述的无菌缓冲液，可以是现有技术已知的任何一种，优选的是PBS缓冲液。步骤(2)中所述的取一级下层沉淀，加入无菌缓冲液，优选的是按体积比1:2-10加入无菌缓冲液。步骤(3)中所述的离心，优选的离心力为500g-5000g。步骤(3)中所述的无菌红细胞裂解液，可以是现有技术已知的任何一种，优选的是155mMNH4CL或10mMKHCO3或0.1mMEDTA。步骤(3)中所述的取二级下层沉淀，加入无菌红细胞裂解液，优选的按体积比1:3-10加入无菌红细胞裂解液。步骤(4)中所述的离心，优选的离心力为30g-800g。步骤(4)中所述的取三级下层沉淀，加入无菌缓冲液，优选的是按体积比1:2-10加入无菌缓冲液。步骤(5)中所述的血清，优选的是自体脐带血血清。步骤(5)中所述的培养基，优选的是MEMALPHA培养基。步骤(5)(6)中所述的离心，优选的离心力为2000g-10000g。步骤(6)中所述的经培养处理，涵盖多种有效处理方式和其他的等同处理方式，例如洗涤/培养、过滤/培养等；优选的是洗涤/培养，培养天数可从0天到14天不等；进一步地，洗涤/培养可以是PBS洗涤/培养，如次数超过2次(包括2次)，培养时间可缩短，甚至不用培养。本专利技术另一方面提供了一种脐带血再生粒子的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)取脐带血进行30g-1000g离心，离心后分为一级上层溶液和一级下层沉淀；(2)取一级下层沉淀，加入无菌PBS缓冲液，进行30g-1000g离心，离心后分为二级上层溶液和二级下层沉淀；(3)取二级下层沉淀，加入无菌红细胞裂解液，置于水平摇床摇动，待完全裂解后进行500g-5000g离心，离心后分为三级上层溶液和三级下层沉淀，三级上层溶液直接弃掉。(4)取三级下层沉淀，加入无菌PBS缓冲液，剧烈晃动，之后进行30g-800g离心，离心后分为四级上层溶液和四级下层沉淀，四级下层沉淀直接弃掉。(5)分别取一级上层溶液、二级上层溶液、四级上层溶液，进行2000g-10000g离心，离心后，收集所有沉淀，加入pH值7.0-7.4、含有血清的培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，每2-3天更换培养基一次。(6)经培养处理，检测合格后，收集所有培养成分，2000g-10000g离心收集脐带血再生粒子。以上所有步骤均在无菌环境下进行操作。步骤(1)中所述的脐带血必须是新鲜、无菌、无病原体的。步骤(2)中所述的取一级下层沉淀，加入无菌缓冲液，优选的是按体积比1:2-10加入无菌缓冲液。步骤(3)中所述的无菌红细胞裂解液，可以是现有技术已知的任何一种，优选的是155mMNH4CL或10mMKHCO3或0.1mMEDTA。步骤(3)中所述的取二级下层沉淀，加入无菌红细胞裂解液，优选的按体积比1:3-10加入无菌红细胞裂解液。步骤(4)中所述的取三级下层沉淀，加入无菌缓冲液，优选的是按体积比1:2-10加入无菌缓冲液。步骤(5)中所述的血清，优选的是自体脐带血血清。步骤(5)中所述的培养基，优选的是MEMALPHA培养基。步骤(6)中所述的经培养处理，涵盖多种有效处理方式和其他的等同处理方式，例如洗涤/培养、过滤/培养等；优选的是洗涤/培养，培养天数可从0天到14天不等；进一步地，洗涤/培养可以是PBS洗涤/培养，如次数超过2次(包括2次)，培养时间可缩短，甚至不用培养。本专利技术第二方面提供了通过第一方面所述制备方法得到的脐带血再生粒子，其方法包括如下步骤：(1)取新鲜、无菌、无病原体的脐带血进行30g-1000g离心，离心后分为一级上层溶液和一级下层沉淀；(2)取一级下层沉淀，按体积比1:2-10加入无菌PBS缓冲液，进行30g-1000g离心，离心后分为二级上层溶液和二级下层沉淀；(3)取二级下层沉淀，按体积比1:3-10加入无菌红细胞裂解液(155mMNH4CL，10mMKHCO3和0.1mMEDTA)，置于水平摇床摇动，待完全裂解后进行500g-5000g离心，离心后分为三级上层溶液和三级下层沉淀，三级上层溶液直接弃掉。(4)取三级下层沉淀，按体积比1:2-10加入无菌PBS缓冲液，剧烈晃动，之后进行30g-800g离心，离心后分为四级上层溶液和四级下层沉淀，四级下层沉淀直接弃掉。(5)分别取一级上层溶液、二级上层溶液、四级上层溶液，进行2000g-10000g离心，离心后，收集所有沉淀，加入pH值7.0-7.4、含有脐带血血清的MEMALPHA培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，每2-3天更换培养基一次。(6)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带血再生粒子的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：S1、取脐带血进行离心分层，离心分层后分为一级上层溶液和一级下层沉淀；S2、取一级下层沉淀，加入无菌缓冲液，进行离心分层，离心分层后分为二级上层溶液和二级下层沉淀，该无菌缓冲液可以是现有技术已知的任何一种；S3、取二级下层沉淀，加入无菌红细胞裂解液，置于水平摇床摇动，待完全裂解后进行离心分层，离心分层后分为三级上层溶液和三级下层沉淀，三级上层溶液直接弃掉，该无菌红细胞裂解液可以是现有技术已知的任何一种；S4、取三级下层沉淀，加入无菌缓冲液，剧烈晃动，之后进行离心分层，离心分层后分为四级上层溶液和四级下层沉淀，四级下层沉淀直接弃掉，该无菌缓冲液可以是现有技术已知的任何一种；S5、分别取一级上层溶液、二级上层溶液、四级上层溶液，进行离心分层，离心分层后，收集所有沉淀，加入pH值7.0‑7.4、含有血清的培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，每2‑3天更换培养基一次；S6、经培养处理，检测合格后，收集所有培养成分，离心收集脐带血再生粒子，所述经培养处理涵盖多种有效处理方式如洗涤/培养、过滤/培养。

【技术特征摘要】
1.一种脐带血再生粒子的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：S1、取脐带血进行离心分层，离心分层后分为一级上层溶液和一级下层沉淀；S2、取一级下层沉淀，加入无菌缓冲液，进行离心分层，离心分层后分为二级上层溶液和二级下层沉淀，该无菌缓冲液可以是现有技术已知的任何一种；S3、取二级下层沉淀，加入无菌红细胞裂解液，置于水平摇床摇动，待完全裂解后进行离心分层，离心分层后分为三级上层溶液和三级下层沉淀，三级上层溶液直接弃掉，该无菌红细胞裂解液可以是现有技术已知的任何一种；S4、取三级下层沉淀，加入无菌缓冲液，剧烈晃动，之后进行离心分层，离心分层后分为四级上层溶液和四级下层沉淀，四级下层沉淀直接弃掉，该无菌缓冲液可以是现有技术已知的任何一种；S5、分别取一级上层溶液、二级上层溶液、四级上层溶液，进行离心分层，离心分层后，收集所有沉淀，加入pH值7.0-7.4、含有血清的培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，每2-3天更换培养基一次；S6、经培养处理，检测合格后，收集所有培养成分，离心收集脐带血再生粒子，所述经培养处理涵盖多种有效处理方式如洗涤/培养、过滤/培养。2.根据权利要求1所述的脐带血再生粒子的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述的脐带血必须是新鲜、无菌、无病原体的；步骤S1中所述的离心，优选的离心力为30g-1000g。3.根据权利要求1所述的一种脐带血再生粒子的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述的离心，优选的离心力为30g-1000g；步骤S2中所述的无菌缓冲液，优选的是PBS缓冲液；步骤S2中所述的取一级下层沉淀，加入无菌缓冲液，优选的是按体积比1:2-10加入无菌缓冲液。4.根据权利要求1所述的一种脐带血再生粒子的制备方法，其特征在于：步骤S...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔五一，
申请(专利权)人：孔五一，
类型：发明
国别省市：北京,11