一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种DC‑CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法，将内装采用统一标准配制的调制CIK细胞因子激活液IL2的试剂瓶、调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、调制CIK细胞因子激活液IFN‑γ的试剂瓶、调制DC细胞因子激活液IL‑4和GM‑CSF混合液的试剂瓶、调制DC细胞因子激活液TNF‑α的试剂瓶、无血清培养液的试剂瓶的六个容器一同放入一个试剂盒内，在培养DC‑CIK细胞时无需另行配置培养基和诱导因子，缩短了培养细胞的时间，统一配置试剂，降低了培养过程中染菌的风险，同时使用方便，节省人力，可以在较短的时间内培养出质量均一的CIK细胞。

A Kit for Inducing Activation of DC-CIK Cells and Its Application

The invention discloses an induction activation kit for DC CIK cells and its application method. The kit contains a uniform standard preparation of a reagent bottle for modulating CIK cytokine activation liquid IL2, a reagent bottle for modulating CIK cytokine activation liquid CD3, a reagent bottle for modulating CIK cytokine activation liquid IFN_gamma, a reagent bottle for modulating the mixture of DC cytokine activation liquid IL_4 and GM CSF, and a reagent bottle for modulating DC fine. Six containers of TNF_alpha cytokine activating liquid and serum-free culture liquid were put into a kit together. When DC_CIK cells were cultured, no additional medium and inducible factors were needed. The time of culturing cells was shortened, reagents were uniformly allocated, and the risk of infection in the process of culture was reduced. At the same time, it was convenient to use and saved manpower. It could be used in a shorter time. Uniform CIK cells were cultured.

【技术实现步骤摘要】
一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法
本专利技术涉及试剂盒或试剂箱
，具体涉及一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类生存和健康的几大主要病因之一。肿瘤三大治疗手段：手术治疗、放射治疗、化学治疗。肿瘤患者术后化疗或者放疗可提高无病进展生存时间(progression-freesurvival，PFS)与总生存时间(overallsurvival，OS)，但总体疗效仍有限，所以更加需要寻求综合抗肿瘤治疗途径，以延长肿瘤患者的生存期。肿瘤生物治疗被认为是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。生物免疫疗法是通过从体外补充、诱导或活化机体内本来固有的生物应答调节系统，活化和调动具有细胞毒活性的生物活性细胞和细胞因子，以调整各种免疫杀伤性的生物反应。目前在免疫治疗方面研究应用较多的有淋巴因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤(cytokineinducedkiller，CIK)细胞、树突状细胞(Dendriticcells，DC)、共培养免疫(DC-CIK)细胞、自然杀伤细胞型的淋巴细胞，其中DC和CIK细胞是肿瘤免疫治疗的两个重要部分。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercell，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，它是将人外周血单个核细胞在体外用多种因子(抗CD3抗体、IL-2、IFN-γ等)诱导扩增一段时间后，获得的一群异质性细胞，具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和非主要组织相容性复盒体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性杀瘤的优点。而树突状细胞(dendriticcell，DC)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，APC)，DC是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，表面具有丰富的有助于抗原呈递的分子，如主要组织相容性复盒体Ⅰ、Ⅱ，共刺激分子B7-1、B7-2，细胞黏附分子1、3以及淋巴细胞功能相关抗原1、3等，能有效激活初始T细胞，引发机体长生抗肿瘤免疫反应。近年来随着对DC和CIK抗肿瘤的研究深入，临床应用发现单独应用DC、CIK细胞治疗肿瘤效果并不是很理想，肿瘤细胞对这些免疫效应细胞发生抵抗导致过继免疫疗效不佳，但将两者联合使用会表现出协同作用，所以临床目前将DC-CIK共培养使用，但在培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中的工作量大，培养时间长，染菌风险大，使许多研究人员很难在短时间内培养出质量均一的DC-CIK细胞。因此，有必要设计一种新的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法，以克服上述缺陷。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法，在短时间内能够培养出质量均一的DC-CIK细胞。本专利技术的目之一在于提供一种DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，包含盒盖和盒体，该盒体内部设有一个海绵托，该海绵拖上设有六个固定孔，该六个固定孔内分别放置有内容调制CIK细胞因子激活液IL-2的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶、内容无血清培养液的试剂瓶。较佳的，IL-2的浓度为500-1500U/ml，CD3的浓度为30-120ng/mL，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为100-800U/ml，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为500U/ml，TNF-α的浓度为100-800U/ml，IFN-γ的浓度为400-1600U/ml。较佳的，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为500U/ml；和/或，IL-2的浓度为1000U/ml。较佳的，CD3的浓度为100ng/mL。较佳的，TNF-α的浓度为500U/ml。较佳的，IFN-γ的浓度为1000U/ml。为达上述目的，本专利技术还提供一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，用于DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，该试剂盒包括调制CIK细胞因子激活液IL-2、调制CIK细胞因子激活液CD3、调制CIK细胞因子激活液IFN-γ、调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液、调制DC细胞因子激活液TNF-α、无血清培养液，该应用方法包括如下步骤：抽外周血100ml，收集于四联血袋；血液预处理:将所采集100ml外周血，置于2支50ml的离心管中,离心(500-1000g,10-35min),上清转移至50ml离心管待处理备用，下部的细胞作密度梯度离心分离PBMC(外周血单核细胞)用；细胞的分离：血液预处理获得的下层细胞用生理盐水1:1稀释，混匀。将40ml淋巴细胞分离液等量均分放入50ml刻度离心管，将离心管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入离心管，滴加过程中注意用力均匀，避免破坏分离液-白细胞界面的完整性，离心(500-1000g,15-45min，离心机升降速调到最慢)，离心后，管内液体分为三层，移液管弃去上层约15ml液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带(即所需PBMC，约5ml)放入离心管，生理盐水洗2次(600g,8min)后弃上清，从试剂盒中取出无血清细胞培养基，每管40ml无血清细胞培养液重悬细胞分离所获得的PBMC；接种细胞：将40mlPBMC细胞悬液加入细胞培养瓶1，置饱和湿度、37℃、3.0％-10％CO2条件下培养。2小时后，收集悬浮细胞，并用无血清培养液调整细胞浓度到1X106/ml,在其中加入IFN-γ培养(400-1600U/ml)。24小时后，从试剂盒中取出细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)和CD3(30-120ng/mL)各40μl，用于CIK细胞诱导；向细胞培养瓶1中的贴壁细胞加入20mlDC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液，用于DC细胞诱导培养；培养至第三天，补加无血清细胞培养液40ml，40μl细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)至培养瓶使培养液总体积为80ml；培养至第四天，CIK细胞：使用50ml医用注射器将每个培养瓶中细胞悬液等量均分转入2个细胞培养袋，加入无血清细胞培养液(≥400ml/袋)和细胞因子激活液IL-2，使细胞终浓度约为1×105cells/ml，IL-2终浓度为500IU/ml，置饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养。DC细胞：培养至第四天，向DC细胞培养瓶中加入10ulDC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液；培养至第6天，CIK细胞：每袋添加细胞因子激活液IL-2，使其终浓度为500IU/ml。DC细胞：加入肿瘤抗原5ul。培养至第7天，DC细胞：加入DC细胞诱导因子TNF-α(100-800U/ml)，10ul；培养至第8天，将1/2的DC细胞冻存为2份，分别标示为DC疫苗1、DC疫苗2，剩余DC细胞与CIK细胞共培养并向其中添加1.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，并计数。抽取5ml/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DC‑CIK细胞诱导活化的试剂盒，其特征在于，包含盒盖和盒体，该盒体内部设有一个海绵托，该海绵拖上设有六个固定孔，该六个固定孔内分别放置有内容调制CIK细胞因子激活液IL‑2的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液IFN‑γ的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液IL‑4和GM‑CSF混合液的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液TNF‑α的试剂瓶、内容无血清培养液的试剂瓶。

【技术特征摘要】
1.一种DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，其特征在于，包含盒盖和盒体，该盒体内部设有一个海绵托，该海绵拖上设有六个固定孔，该六个固定孔内分别放置有内容调制CIK细胞因子激活液IL-2的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶、内容无血清培养液的试剂瓶。2.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IL-2的浓度为500-1500U/ml，CD3的浓度为30-120ng/ml，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为100-800U/ml，TNF-α的浓度为100-800U/ml，IFN-γ的浓度为400-1600U/ml。3.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为500U/ml；和/或，IL-2的浓度为1000U/ml。4.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，CD3的浓度为100ng/ml。5.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，TNF-α的浓度为500U/ml。6.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IFN-γ的浓度为1000U/ml。7.一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，用于DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，该试剂盒包括调制CIK细胞因子激活液IL-2、调制CIK细胞因子激活液CD3、调制CIK细胞因子激活液IFN-γ、调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液、调制DC细胞因子激活液TNF-α、无血清培养液，其特征在于，该应用方法包括如下步骤：抽外周血100ml，收集于四联血袋；血液预处理:将所采集100ml外周血，置于2支50ml的离心管中,离心(500-1000g,10-35min),上清转移至50ml离心管待处理备用，下部的细胞作密度梯度离心分离PBMC(外周血单核细胞)用；细胞的分离：血液预处理获得的下层细胞用生理盐水1:1稀释，混匀。将40ml淋巴细胞分离液等量均分放入50ml刻度离心管，将离心管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入离心管，滴加过程中注意用力均匀，避免破坏分离液-白细胞界面的完整性，离心(500-1000g,15-45min，离心机升降速调到最慢)，离心后，管内液体分为三层，移液管弃去上层约15ml液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带(即所需PBMC，约5ml)放入离心管，生理盐水洗2次(600g,8min)后弃上清，从试剂盒中取出无血清细胞培养基，每管40ml无血清细胞培养液重悬细胞分离所获得的PBMC；接种细胞：将40mlPBMC细胞悬液加入细胞培养瓶1，置饱和湿度、37℃、3.0％-10％CO2条件下培养。2小时后，收集悬浮细胞，并用无血清培养液调整细胞浓度到1X106/ml,在其中加入IFN-γ培养(400-1600U/ml)。24小时后，从试剂盒中取出细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)和C...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光，
申请(专利权)人：苏州明基医院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32