单根核壳纳米线的酶型电化学传感器及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种单根核壳纳米线的酶型电化学传感器及其制备方法与应用。制备方法的特征在于，包括以下步骤：步骤1.在单根核壳纳米线电极的尖端滴加带核正电性的聚合物液滴，室温下干燥，其中，聚合物的分子量在8000以上，聚合度为200～300；步骤2.在步骤1获得的纳米线电极的尖端滴加酶、交联剂和封闭蛋白的混合溶液液滴，在1～8℃条件下干燥保存，得到酶型纳米电化学传感器。本发明专利技术通过共价交联的方式将酶修饰在纳米线电极的表面，得到单根核壳纳米线的酶型纳米电化学传感器，该酶型纳米电化学传感器具有高灵敏度、高时空分辨率、实时定量检测等优点，能够应用于生物医学分析中，在胞内非电活性小分子检测方面具有显著优势。

Enzymatic electrochemical sensor based on single core-shell nanowires and its preparation method and Application

The invention provides an enzymatic electrochemical sensor with a single core-shell nanowire, a preparation method and application thereof. The preparation method is characterized by the following steps: step 1. dropping positive charged polymer droplets onto the tip of a single core-shell Nanowire Electrode and drying at room temperature, in which the molecular weight of the polymer is more than 8000 and the degree of polymerization is 200-300; step 2. dropping enzyme, crosslinker and protein-blocking mixed solution droplets on the tip of the nanowire electrode obtained in step 1, at 1-8. Enzyme-based Nano-electrochemical sensors were prepared by drying at C. The enzymatic Nano-electrochemical sensor with single core-shell nanowires is obtained by covalently crosslinking enzymes on the surface of nanowire electrodes. The enzymatic Nano-electrochemical sensor has the advantages of high sensitivity, high spatial and temporal resolution, real-time quantitative detection, etc. It can be applied in biomedical analysis and has significant advantages in detecting intracellular non-electroactive small molecules.

【技术实现步骤摘要】
单根核壳纳米线的酶型电化学传感器及其制备方法与应用
本专利技术属于电化学传感器领域，具体涉及一种单根核壳纳米线的酶型电化学传感器及其制备方法与应用。技术背景细胞胞内小分子参与各种生理信号通路，胞内小分子的检测在了解细胞异质性方面有重要意义。由于胞内小分子大多无电化学活性，不能直接通过电化学进行定量检测，当前亟待开发出简单、对细胞损伤小、高灵敏度、高时空分辨率、能实时定量检测的新型酶纳米电极。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种制备过程简单、操作简便易行、成本低、重复性好的单根核壳纳米线的酶型电化学传感器，及其制备方法和在胞内非电活性小分子检测中的应用。本专利技术为了实现上述目的，采用了以下方案：<制备方法>本专利技术提供单根核壳纳米线的酶型电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.在单根核壳纳米线电极的尖端滴加带核正电性的聚合物液滴，室温下干燥，其中，聚合物的分子量在8000以上，聚合度200～300；步骤2.在步骤1获得的纳米线电极的尖端滴加酶、交联剂和封闭蛋白的混合溶液液滴，在1～8℃条件下干燥保存，得到酶型纳米电化学传感器。在1～8℃条件下干燥保存可以很好的维持酶的活性，延长传感器的保存寿命。优选的，在步骤1中，聚合物的Mw/Mn值在1.5～3之间，聚合度为240～260，这样有利于携带大量核正电性官能团，并且有利于将酶吸附在其表面。优选的，在步骤1中，聚合物液滴的浓度为0.08～0.15％w/v，最佳为0.1％w/v。优选的，在步骤1中，是在单根核壳纳米线电极的尖端采用悬挂法滴加带核正电性的聚合物液滴。由于纳米线电极尺寸较小，与一般的将电极浸泡在聚合物溶液相比，采用悬挂的方式可以最大程度的将聚合物集中在纳米线电极尖端，所需的聚合物样品量较少，其电极表面所吸附的聚合物量与浸泡法相比更多，更有利于酶的吸附。优选的，在步骤2中，每毫升混合溶液液滴中，酶含量为100～1000U，交联剂含量为8～15mg，封闭蛋白含量为1～3mg。这样的浓度和比例关系有利于电子传递速率，提升传感器的快速响应能力。更优选的，在步骤2中，每毫升混合溶液液滴中，交联剂含量为10mg，封闭蛋白含量为2mg。优选的，在步骤2中，是在纳米线电极的尖端采用悬挂法滴加混合溶液液滴。采用悬挂法，可最大限度将酶修饰溶液停留在纳米线尖端，增大修饰的酶量，可提高传感器的检测性能。<酶型电化学传感器>进一步，本专利技术还提供了单根核壳纳米线的酶型电化学传感器，其特征在于：采用上述<制备方法>中所描述的制备方法制得。<应用>更进一步，本专利技术还提供了单根核壳纳米线的酶型电化学传感器在胞内非电活性小分子检测中的应用。具体地，采用该单根核壳纳米线的酶型电化学传感器检测细胞胞内小分子的方法为：(1)将单根核壳纳米线的酶型纳米电化学传感器靠近细胞，用来检测细胞释放到胞外的小分子含量；(2)将单根核壳纳米线的酶型纳米电化学传感器插入细胞，用来检测细胞胞内的小分子含量。专利技术的作用与效果：本专利技术通过共价交联的方式将酶修饰在纳米线电极的表面，得到单根核壳纳米线的酶型纳米电化学传感器，该酶型纳米电化学传感器具有高灵敏度、高时空分辨率、实时定量检测等优点，能够应用于生物医学分析中，在胞内非电活性小分子检测方面具有显著优势。本专利技术操作简便易行、成本低、重复性好，在一般化学及生物化学实验室均能完成。附图说明图1为本专利技术实施例一中涉及的SiC@C/Pt纳米线电极的扫描电镜图，标尺均为1μm；图2为本专利技术实施例一中涉及的酶修饰的SiC@C/Pt纳米线电极的扫描电镜图，标尺均为1μm；图3为本专利技术实施例一中涉及的酶修饰的SiC@C/Pt纳米线电极的红外光谱图；图4为本专利技术实施例一中涉及的酶修饰的SiC@C/Pt纳米线电极插入细胞内检测胞内葡萄糖的放大图，标尺为20μm；图5为本专利技术实施例一中涉及的酶修饰的SiC@C/Pt纳米线电极所收集的胞内葡萄糖信号图；图6为本专利技术实施例二中涉及的酶修饰的SiC@C/Pt纳米线电极靠近神经细胞曲张体检测谷氨酸的放大图，标尺为5μm。具体实施方式以下结合附图对本专利技术涉及的单根核壳纳米线的酶型电化学传感器及其制备方法与应用的具体实施方案进行详细地说明。<实施例一>制备单根核壳纳米线的酶型电化学传感器的具体步骤如下：(1)将商用化的SiC纳米线放入到无水乙醇中超声分散约2分钟；(2)将超声分散好的纳米线滴加在载玻片上，在90℃下加热使溶剂挥发，分别用无水乙醇、三次水润洗使纳米线离散均匀，加热烘干，后用玻璃刀剪裁制片；(3)用激光拉制仪将石英玻璃管拉制成尖端约为1-2μm的锥形管备用；(4)在显微镜两侧分别固定步骤(2)制备的载玻片和步骤(3)拉制的锥形石英管，在显微镜下操作，将载玻片边缘伸展的单根纳米线部分插入到锥形石英管中，暴露出的纳米线长约为20-30μm；(5)将步骤(4)得到的锥形石英管放入自制的加热管中，通入丁烷气体，采用气相沉积法(参数直流电～50V，调节电流为0.97A，加热1-2分钟)，在纳米线上沉积一层纳米级别的碳层，并用丙酮除去多余杂质；(6)用激光拉制仪将硼酸盐玻璃管拉制成尖端约为1μm的锥形管备用；(7)在步骤(6)得到的硼酸盐锥形管中注入液态金属，在1000g的离心力下离心3分钟，将液态金属推送至距离锥形管尖端10-20μm处，随后用聚乙烯蜡进行密封；(8)将步骤(7)得到的硼酸盐锥形管放入加热管中，在0.25A条件下加热使纳米线尖端蜡熔融，将步骤(5)中沉积有碳层的纳米线插入硼酸盐锥形管的液态金属中制备SiC@C纳米线电极，暴露的纳米线电极长度约为5-10μm；(9)采用循环伏安法，-0.5—0V，扫速100mV/s，在步骤(8)得到的SiC@C纳米线电极尖端进行局部镀铂，镀铂电量约50μC，制备得到SiC@C/Pt纳米线电极如图1电极扫描电镜图所示；(10)在步骤(9)得到的SiC@C/Pt纳米线电极尖端采用悬挂法滴加聚乙烯亚胺(0.1％w/v)，室温下干燥。(11)在步骤(10)得到的纳米线电极尖端采用悬挂法滴加聚乙二醇二缩水甘油醚(10mg/ml)、牛血清蛋白(2mg/ml)和葡萄糖氧化酶(1000U/ml)的混合溶液，放置在4℃冰箱内进行干燥保存，将单根核壳纳米线酶型电化学传感器进行扫描电镜表征如图2所示，并用显微红外光谱仪表征蛋白上的官能团(图3)，表明酶已成功修饰在传感器表面。本实施例中，是将数根电极捆绑成束，然后再将液滴悬挂上去，保持液滴不会掉落下来，直接在电极尖端上干透。悬挂液滴的原则是要使液滴将电极的最外围包覆住，并且不会滑落，能直接在电极尖端上干透。(12)将人正常肝细胞(LO2)接种到装有小圆形载玻片(直径7mm)的小皿中，加入1640培养基培养12小时用于细胞电化学检测实验。所有细胞实验均在与膜片钳放大器(EPC-10，HEKAElectronics，Germany)耦合的倒置显微镜上进行。通过显微操纵器(TransferManNK2，Eppendorf)，如图4所示，在40倍物镜下将葡萄糖氧化酶修饰的SiC@C/Pt纳米线电极放置在细胞膜附近，然后纳米线电极缓缓向前移动并插入细胞，Ag/AgC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.单根核壳纳米线的酶型电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.在单根核壳纳米线电极的尖端滴加带核正电性的聚合物液滴，室温下干燥，其中，聚合物的分子量在8000以上，聚合度为200～300；步骤2.在步骤1获得的纳米线电极的尖端滴加酶、交联剂和封闭蛋白的混合溶液液滴，在1～8℃条件下干燥保存，得到所述酶型纳米电化学传感器。

【技术特征摘要】
1.单根核壳纳米线的酶型电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.在单根核壳纳米线电极的尖端滴加带核正电性的聚合物液滴，室温下干燥，其中，聚合物的分子量在8000以上，聚合度为200～300；步骤2.在步骤1获得的纳米线电极的尖端滴加酶、交联剂和封闭蛋白的混合溶液液滴，在1～8℃条件下干燥保存，得到所述酶型纳米电化学传感器。2.根据权利要求1所述的单根核壳纳米线的酶型电化学传感器的制备方法，其特征在于：其中，在所述步骤1中，聚合物的Mw/Mn值在1.5～3之间，聚合度为240～260。3.根据权利要求1所述的单根核壳纳米线的酶型电化学传感器的制备方法，其特征在于：其中，在所述步骤1中，聚合物液滴的浓度为0.08～0.15％w/v。4.根据权利要求1所述的单根核壳纳米线的酶型电化学传感器的制备方法，其特征在于：其中，在所述步骤1中，聚合物液滴的浓度为0.1％w/v。5.根据权利要求1所述的单根核壳纳米线的酶型电...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄卫华，张欣伟，姜宏，廖全兰，邱权发，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42