通用无标记LIC载体pMF-LIC及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种通用无标记LIC载体pMF‑LIC及其构建方法与应用，其是以质粒pJG100为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物对进行PCR扩增，得到目的片段LIC序列；将目的片段LIC序列用限制性内切酶Xba I和Sac I双酶切，再与经同样双酶切的pMF‑Npt II质粒连接，获得通用无标记LIC载体pMF‑LIC。本发明专利技术提供的pMF‑LIC载体使用安全，除引入目的基因外不含任何载体的骨架序列；简便，外源待克隆PCR片段不需要酶切和连接反应；高效，不依赖连接酶，很大程度简化了DNA重组过程，且完全靠粘性末端配对退火，载体自连背景低；可以批量处理；成本低。

【技术实现步骤摘要】
通用无标记LIC载体pMF-LIC及其构建方法与应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种通用无标记LIC载体pMF-LIC及其构建方法与应用。
技术介绍
谈到转基因技术，大家就会想到转基因生物安全性的问题。当今，大众对转基因生物的安全性问题非常关注，关注主要集中于对转基因过程中使用的一些筛选标记基因，这些标记基因多数为一些编码抗生素抗性和除草剂抗性的基因。因此，获得一些无标记基因的转基因植物，可能会以提高大众对转基因产品的接受度。到目前为止，已经获得了一些无标记基因的转化植物，但一些方法都是在转化时仍使用标记基因，然后得到阳性转化体后通过各种手段再将筛选标记基因去除，费时费力。另外一些学者在基因转化过程中就使用了无选择标记基因的转化系统，一步到位即可得到无标记基因的转化体。但不管哪种获得无标记转化体的载体，在外源基因克隆的过程中都依赖限制性内切酶，然后再依赖连接酶将外源基因和载体连接。这样将外源基因克隆到载体的方法受到基因序列中原有的酶切位点的限制，在应用中受到一定的局限。同时，如果实验室想将不同基因的克隆到载体，就要考虑每个基因和载体的酶切位点，就需要利用不同的酶切位点，需要购买不同的内切酶，通过多次的酶切和连接来克隆不同的基因，费时费钱。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，有必要构建一个不仅在转化过程中，只导入外源目的基因，不携带选择标记基因的生物安全的无标记载体，而且该无标记载体应该在克隆外源基因过程中，不受酶切位点限制，可以一次操作后克隆任何外源基因的通用无标记载体。本专利技术目的在于提供一种通用无标记LIC载体pMF-LIC，其是采用质粒pMF-NptII和LIC序列构建而成。通用无标记LIC载体pMF-LIC的构建方法包括步骤：以质粒pJG100为模板，以SEQIDNo.1(LICR：5’-GACTCTAGAGGTACCTTCGACGACAAGACCGG-3’)和SEQIDNo.2(LICF：5’-TGGGAGCTCGAGGAGAAGAGCCGGGCCCCTAC-3’)为引物对进行PCR扩增，得到目的片段LIC序列；将目的片段LIC序列用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切，再与经同样双酶切的pMF-NptII质粒连接，获得通用无标记LIC载体pMF-LIC。本专利技术另一种目的在于提供一种携带抗晚疫病基因R1的重组载体，其是采用通用无标记LIC载体pMF-LIC和抗晚疫病基因R1构建而成。携带抗晚疫病基因R1的重组载体的构建方法包括步骤：以携带抗晚疫病基因R1的pCLD04541-R1为模板，以SEQIDNo.3(R1R：5’-CGACGACAAGACCGTACCATGAATTTCAACAATGAATTGTCTGATC-3’)和SEQIDNo.4(R1F：5’-GAGGAGAAGAGCCGTCTATCTTATTTCTGCAAGAATATTTTTTAC-3’)为引物对进行PCR扩增，得到抗晚疫病基因R1；将抗晚疫病基因R1用限制性内切酶ApaI酶切，再与经同样酶切的通用无标记LIC载体pMF-LIC连接，获得携带抗晚疫病基因R1的重组载体。本专利技术的另一种目的在于提供一种携带抗晚疫病基因R1的重组载体的微生物转化体，其是以农杆菌为受体而转化得到；优选地，农杆菌为农杆菌AGL0。携带抗晚疫病基因R1的重组载体的微生物转化体的构建方法包括步骤：采用三亲融合的方法，将携带抗晚疫病基因R1的重组载体转入农杆菌中，得到携带抗晚疫病基因R1的重组载体的微生物转化体。本专利技术还保护通用无标记LIC载体pMF-LIC、携带抗晚疫病基因R1的重组载体或携带抗晚疫病基因R1的重组载体的微生物转化体在提高植物抗晚疫病效果中的应用。优选地，植物为马铃薯，优选为马铃薯品种Desiree。本专利技术的另一种目的在于提供一种培育提高抗晚疫病效果的植物的方法，包括使用通用无标记LIC载体pMF-LIC的步骤；或者，包括使用携带抗晚疫病基因R1的重组载体的步骤；或者，包括使用携带抗晚疫病基因R1的重组载体的微生物转化体的步骤。本专利技术的另一种目的在于提供一种转基因马铃薯品种的构建方法，包括步骤：将携带抗晚疫病基因R1的重组载体的微生物转化体采用农杆菌介导的方法侵染马铃薯品种Desiree，得到转基因马铃薯品种。PCR片段和载体在T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性和一种特定的dNTP存在的条件下反应，在其末端生成10～15个碱基的粘性末端。因此，处理过的PCR片段和载体可依靠生成的粘性末端重组，在这个过程中没有用到连接酶。使用这种克隆方法免去了对插入片段序列的考虑，在载体上可以克隆任何需要的基因。而且整个连接过程都不需要使用限制性内切酶和连接酶，PCR片段和载体是在体外条件下连接，二者处理后生成的粘性末端退火互补形成双链环状分子，经转化进入大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突出和缺口而得到正确重组子。本专利技术提供的通用无标记LIC载体pMF-LIC，具有如下的有益效果：(1)安全：用该载体进行基因转化，得到的转基因材料，除了引入目的基因外，不含任何载体的骨架序列；(2)简便：外源待克隆的PCR片段不需要酶切和连接反应，简化了各种酶切位点在引物设计时的思考麻烦；(3)批处理：多个基因在实验过程中可以一同操作，同时同样处理所有的样品，省时省力；(4)高效：该方法不依赖连接酶，很大程度上简化了DNA重组过程，且完全靠粘性末端配对退火，载体自连背景低；另外，也不用考虑载体末端的磷酸化等现状；(5)省钱：该方法只需T4DNA聚合酶和dATP及dTTP，以及带有额外10-15bp附加碱基的引物，而且克隆过程中省去了连接酶，也没有使用价格不菲的特殊重组酶。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术实施例中pMF-LIC构建示意图；图2为本专利技术实施例中LIC序列PCR扩增结果图；图3为本专利技术实施例中pMF-LIC质粒XbaI/SacI双酶切及SacI单酶切鉴定结果图；图4为本专利技术实施例中载体pMF-LIC酶切图；图5为本专利技术实施例中pMF-LIC-R1质粒单、双酶切图；图6为本专利技术实施例中转R1基因(R1)与对照(ck)无菌苗接种发病症状结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。(一)构建通用无标记LIC载体pMF-LIC通用无标记LIC载体pMF-LIC的构建示意图如图1所示。1、目的片段LIC序列的扩增、回收、纯化以质粒pJG100为模板，利用引物对LICR/LICF(序列如表1所示)进行PCR扩增，扩增目的片段LIC序列，大小为1.8kb，LIC序列PCR扩增结果如图2所示，其中，1：pJG100扩增；M：1kbDNAMaker。表1引物表引物序列LICR5’-GACTCTAGAGGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通用无标记LIC载体pMF‑LIC，其特征在于：所述通用无标记LIC载体pMF‑LIC是采用质粒pMF‑Npt II和LIC序列构建而成。

【技术特征摘要】
1.一种通用无标记LIC载体pMF-LIC，其特征在于：所述通用无标记LIC载体pMF-LIC是采用质粒pMF-NptII和LIC序列构建而成。2.一种权利要求1所述的通用无标记LIC载体pMF-LIC的构建方法，其特征在于，包括步骤：以质粒pJG100为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为引物对进行PCR扩增，得到目的片段LIC序列；将所述目的片段LIC序列用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切，再与经同样双酶切的pMF-NptII质粒连接，获得所述通用无标记LIC载体pMF-LIC。3.一种携带抗晚疫病基因R1的重组载体，其特征在于：所述重组载体是采用权利要求1所述的通用无标记LIC载体pMF-LIC和抗晚疫病基因R1构建而成。4.一种权利要求3所述的携带抗晚疫病基因R1的重组载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：以携带抗晚疫病基因R1的pCLD04541-R1为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4为引物对进行PCR扩增，得到抗晚疫病基因R1；将所述抗晚疫病基因R1用限制性内切酶ApaI酶切，再与经同样酶切的权利要求1所述的通用无标记LIC载体pMF-LIC连接，获得所述携带抗晚疫病基因R1的重组载体。5.一种含有权利要求3所述的携带抗晚疫病基因R1的重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛翠花，郭江波，池俊玲，肖欢欢，孙玮，贺引弟，
申请(专利权)人：内蒙古科技大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15