一种生物样本中mPEG-PLA的定量测定方法技术

一种生物样本中mPEG‑PLA的定量测定方法，属于药物分析研究技术领域。该测定方法采用高效液相色谱‑质谱进行测定。首先制备标准曲线，然后将待测样本进行测定后通过标准曲线计算待测样本浓度。本发明专利技术中质谱条件基于三重串联质谱技术和源内裂解技术，设定为：mPEG‑PLA通过第一个质量分析器Q1，在特定解簇电压下发生源内裂解，产生并选择特定质荷比母离子，特定质荷比母离子的带电粒子通过第二个质量分析器Q2；在第二个通过质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打成碎片离子；在第三个质量分析器中选取稳定的特征碎片离子，来定量mPEG‑PLA。本发明专利技术针对生物样本中mPEG‑PLA分子量的不唯一性，建立一种操作简单，结果准确可靠的，重现性强的mPEG‑PLA定量分析方法。

A Quantitative Method for the Determination of mPEG-PLA in Biological Samples

A quantitative determination method of mPEG PLA in biological samples belongs to the technical field of pharmaceutical analysis. The method was determined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. Firstly, the standard curve was prepared, and then the concentration of the sample was calculated by the standard curve after the sample was determined. The mass spectrometry conditions in the present invention are based on triple tandem mass spectrometry and in-source pyrolysis technology, and are set as follows: mPEG PLA cracks in the source under a specific cluster voltage through the first mass analyzer Q1, produces and chooses a specific mass-charge ratio parent ion, charged particles of a specific mass-charge ratio parent ion pass through the second mass analyzer Q2, and collision energy is set up in the second mass analyzer Q2. In the third mass analyzer, stable characteristic fragment ions are selected to quantify mPEG PLA. In view of the non-uniqueness of the molecular weight of mPEG PLA in biological samples, the present invention establishes a quantitative analysis method of mPEG PLA with simple operation, accurate and reliable results and strong reproducibility.

【技术实现步骤摘要】
一种生物样本中mPEG-PLA的定量测定方法
本专利技术属于药物分析研究
，涉及一种生物样本中mPEG-PLA含量的测定方法。
技术介绍
化疗药物的临床应用通常受到毒副作用、水溶性差和肿瘤细胞耐药等因素的限制。设计一种理想的药物传递系统，降低毒性，提高使用效率，已成为药物研究的热点。许多新的传递系统如聚合物、脂质体或胶束已被广泛研究并应用，以减少毒性和副作用，增强肿瘤组织靶向性，延长血液循环时间，避免被网状内皮系统(RES)吞噬。在所有纳米药物载体中，聚合物胶束自组装从生物相容性和生物可降解的两亲性嵌段共聚物到水介质的核-壳纳米结构被认为是有前途的药物靶向给药载体。在独特的核-壳结构中，疏水核被延伸到水环境的亲水外壳包围，这为胶束核和水环境之间提供了一个稳定的界面。聚乳酸(PLA)是一种具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、低免疫反应性、低毒性和机械强度的高分子材料，可作为临床和医药的高分子材料。然而，由于PLA疏水性强，降解时间长，其在静脉给药中的应用受到限制。因此，聚乳酸通常与亲水性强的聚乙二醇(PEG)键合共聚，以改变其性能。PEG-PLA嵌段共聚物作为一种新型的药物载体在近年来越来越受到人们的欢迎。聚乙二醇作为常用的高分子辅料，亲水性强，生物相容性好，且不易被网状内皮系统识别，可以保护载药PLA疏水核不被吞噬细胞吞噬，从而延长药物在血液中的循环时间。此外，PLA的生物可降解性在控制药物释放方面具有优势。对于疏水性药物而言，PEG-PLA嵌段中的亲水段PEG可以增加药物的稳定性和溶解度，疏水段PLA可以通过疏水相互作用增加药物负载率。已有研究表明PEG-PLA纳米颗粒能够通过血脑屏障，是中枢神经系统最有利的药物载体之一。近年来，一些PEG-PLA胶束已被批准用于临床试验或上市。GenexolPM是一种以PEG-PLA共聚物胶束为载体紫杉醇制剂，2007年在韩国被批准用于乳腺癌、肺癌和卵巢癌的治疗。目前正在美国进行临床试验。作为新型的药用辅料，PEG-PLA嵌段共聚物的质量控制以及在体内的吸收分布与排泄过程对于PEG-PLA载药制剂的设计与评价具有十分重要的意义。PEG-PLA作为一种高分子聚合物，其分子量不是唯一的，呈正态分布。放射性标记法成本高，且存在放射性污染和危害，传统的比色法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等分析方法不能准确定量高分子辅料，且不适于复杂生物基质样品中大分子的定量分析。超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术的发展使定量分析聚合物辅料成为可能。然而，传统的质谱多重反应监测模式(MRM)只能对单一分子量的化合物进行分析。在传统MRM方法中，在使溶剂充分与带电离子解离的前提下，设置的离子源内的相关参数如碰撞气、解簇电压应尽可能小，以确保带电离子的完整性。然后带电离子进入第一重质量分析器Q1中，经过电场的筛选，具有特定分子量的带电离子进一步进入第二重质量分析器Q2中，在碰撞能量的作用下打碎成一系列的碎片，碎片进入第三重质量分析器杆Q3或离子阱中，在特定电场的作用下再一次选择出稳定的信号响应高的离子作为子离子进入检测器中检测。但本研究所用聚合物分子量不唯一，传统MRM方法无法同时对成千上万个不同母离子的化合物进行分析。另有研究采用基于液相色谱串联Q-Q-TOF质谱的技术分析定量高分子聚合物，在该方法中基于TOFMS扫描技术，所有不同分子量的高分子化合物全部通过Q1进入Q2，在碰撞能量的作用下打碎，选择稳定的碎片进行定量分析。但在该方法中，由于Q2处的碰撞能量强度较大，部分碎片碎裂程度过大，不一定是有规律的结构单元形成的碎片，而这部分碎片不在检测范围内，而且，QQTOF的绝对定量灵敏度要低于QQQ或者Qtrap串联质谱，因此检测的响应比理论值要低。更重要的是，QQTOF质谱作为检测器用于化合物定量分析时，其线性范围较窄，稳定性较差，并不适合低浓度及浓度变化范围较大的生物样品中化合物的分析。
技术实现思路
本专利技术拟解决的技术问题及创新点在于：高分子药用辅料mPEG-PLA分子量不唯一，呈正态分布，而传统MRM只能定量分析分子量确定的化合物，无法对其进行精准定量分析。源内裂解是由于在离子源中存在过度的解簇电压，导致母离子在离子源内被打碎，从而降低了分析的灵敏度。在传统MRM扫描方式中应避免源内裂解的发生。本专利技术将源内CID(碰撞诱导解离)技术结合传统MRM技术，将源内裂解的缺点转化为优点，在离子源内加入特定解簇电位，使溶剂挥发，去除离子簇，让聚合的离子分散进入质量分析器中，同时促使聚合物在源内断裂成一系列具有固定结构单元的稳定特征碎片，作为母离子。例如：含有6个聚乳酸重复单元的特定质荷比母离子m/z为433.0；含有5个聚乳酸重复单元和1个聚乙二醇重复单元的特定质荷比母离子m/z为405.0；含有8个聚乙二醇重复单元的特定质荷比母离子m/z为353.0。在特定解簇电压下，控制离子解簇和碎裂程度，使mPEG-PLA在产生特异性母离子的同时避免被进一步打碎。然后母离子进入Q2，进一步打碎获得稳定的子离子。最后用该特异性离子对对聚合物进行了定量分析。本专利技术提供一种操作简单可行、方法准确可靠、灵敏度高、重现性好的mPEG-PLA定量分析方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种生物样本中mPEG-PLA的定量测定方法，采用液相色谱-离子阱质谱进行测定，选取特定质荷比母离子m/z为433.0，子离子m/z为217.0的特异性离子对mPEG-PLA进行定量分析测定，该测定方法包括以下步骤：步骤A，建立mPEG-PLA测定标准曲线，具体包括以下步骤：(1)制备内标溶液和梯度稀释的不同浓度的mPEG-PLA标准溶液。(2)于抗吸附管中加入内标溶液、空白基质、mPEG-PLA标准溶液和乙腈溶液后涡流混匀，离心后取上清液进样到高效液相色谱-质谱中进行分析。(3)取不同浓度的mPEG-PLA标准溶液重复步骤(2)，记录色谱图，色谱图中mPEG-PLA浓度为横坐标，mPEG-PLA色谱峰面基与内标峰面积的比值为纵坐标，采用加权W＝1/X2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。所述的mPEG-PLA中特异性离子对有如下三种：所述特定质荷比母离子m/z为433.0(6个聚乳酸重复单元)，特征碎片子离子m/z为217.0(3个聚乳酸重复单元)；所述特定质荷比母离子m/z为405.0(5个聚乳酸重复单元和1个聚乙二醇重复单元)，特征碎片子离子m/z为333.0(4个聚乳酸重复单元和1个聚乙二醇重复单元)；所述特定质荷比母离子m/z为353.0(8个聚乙二醇重复单元)，特征碎片子离子m/z为133.1(3个聚乙二醇重复单元)。经确证后，选取仪器响应较高的特定质荷比母离子m/z为433.0，子离子m/z为217.0作为特异性离子对进行定量分析。步骤B，采用液相色谱-离子阱质谱测定待测样品，并通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中mPEG-PLA的浓度，具体包括以下步骤：(1)于抗吸附管中加入内标溶液、待测样本、mPEG-PLA待测样本和乙腈溶液后涡流混匀，离心后取上清液进样到高效液相色谱-质谱中进行分析，得到待测样本mPEG-PLA的峰面积与内标峰面积。(2)将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物样本中mPEG‑PLA的定量测定方法，其特征在于，该测定方法采用液相色谱‑离子阱质谱，并选取特定质荷比母离子m/z为433.0，子离子m/z为217.0的特异性离子对mPEG‑PLA进行定量分析测定，该测定方法包括以下步骤：步骤A，建立mPEG‑PLA测定标准曲线；步骤B，采用液相色谱‑离子阱质谱测定待测样品，并通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中mPEG‑PLA的浓度；所述的步骤B与步骤A的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件为在串联质谱技术上结合源内裂解技术，质谱部分设定为：mPEG‑PLA通过第一个质量分析器Q1，在特定解簇电压下发生源内裂解，产生并选择特定质荷比母离子，特定质荷比母离子通过第二个质量分析器Q2；在第二个通过质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电离子打成碎片离子；在第三个质量分析器中选取稳定的特征碎片作为子离子，进入质量分析器检测，对mPEG‑PLA进行分析定量。

【技术特征摘要】
1.一种生物样本中mPEG-PLA的定量测定方法，其特征在于，该测定方法采用液相色谱-离子阱质谱，并选取特定质荷比母离子m/z为433.0，子离子m/z为217.0的特异性离子对mPEG-PLA进行定量分析测定，该测定方法包括以下步骤：步骤A，建立mPEG-PLA测定标准曲线；步骤B，采用液相色谱-离子阱质谱测定待测样品，并通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中mPEG-PLA的浓度；所述的步骤B与步骤A的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件为在串联质谱技术上结合源内裂解技术，质谱部分设定为：mPEG-PLA通过第一个质量分析器Q1，在特定解簇电压下发生源内裂解，产生并选择特定质荷比母离子，特定质荷比母离子通过第二个质量分析器Q2；在第二个通过质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电离子打成碎片离子；在第三个质量分析器中选取稳定的特征碎片作为子离子，进入质量分析器检测，对mPEG-PLA进行分析定量。2.根据权利要求1所述的一种生物样本中mPEG-PLA的定量测定方法，其特征在于：质谱条件为：正离子方式检测：离子喷雾电压：5500V；温度：500℃；气帘气体(CUR)氮气压力为35psi；气体1氮气压力(GS1)为50psi、气体2氮气压力(GS1)50psi；mPEG-PLA扫描方式为MRM，解簇电压为50V，质量分析器Q2中碰撞能量为26eV；色谱条件为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：史美云，姜惠，尹磊，徐梦谣，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21