本发明专利技术提供水稻OsHIR3基因在制备植物防御病毒或者细菌侵染危害上的用途以及制备方法,其中所述的方法包括：水稻OsHIR3基因构建到植物双元表达载体中，通过电击导入农杆菌菌株；通过水稻成熟胚诱导法获得过表达OsHIR3的转基因水稻。这样的植物具有基础抗病毒或者细菌病害的能力，主要是提高了植物体内SA的水平。
The Use of OsHIR3 Gene in Rice and the Method of Obtaining Disease Resistant Rice
The present invention provides the application and preparation method of rice OsHIR3 gene in preparing plant defense virus or bacterial infection hazard. The methods include: constructing rice OsHIR3 gene into plant binary expression vector, introducing Agrobacterium strains by electric shock, and obtaining transgenic rice overexpressing OsHIR3 by Rice Mature Embryo Induction method. Such plants have the basic ability to resist viruses or bacterial diseases, mainly improving the level of SA in plants.
【技术实现步骤摘要】
水稻OsHIR3基因的用途以及获得抗病水稻的方法
本专利技术涉及基因工程
及植物病害防治领域，尤其涉及植物OsHIR3s基因在植物基础抗性中的应用领域。
技术介绍
水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)能够引起水稻条纹叶枯病。灰飞虱(Lapdelphaxstriatellus,SBPH)是RSV传播的介体，经灰飞虱传播引起的水稻条纹叶枯病，是我国水稻生产中重要的病毒病害，对农业生产安全造成极大威胁。过敏反应(HR)是植物阻止病原物侵染传播的一种防御机制，其主要特征是侵染周围局部细胞的快速死亡,通过诱导局部的过敏反应即封闭损伤位点以抵御病原菌的进一步侵染。过敏诱导反应基因(HIR)家族被认为是和HR紧密相关的，参与植物对病原物的抗性反应中。目前已鉴定HIR家族的许多成员与普通烟HR诱导蛋白NG1非常相似，NG1作为HR的激活子，能够诱导类HR的坏死斑。大麦快中子突变体植株上HvHIR3上调表达35倍，叶片表现出自发的HR，表明HIR基因能够诱导HR。随后，豆科植物、黄瓜、水稻和小麦中的HIRs被鉴定为与小孢子发育和细菌侵染反应相关。之前的研究主要集中在HIR1，对其他HIRs研究较少。过表达水稻OsHIR1的转基因拟南芥表现出对丁香假单胞杆菌Pst.DC3000的抗性。目前尚不清楚HIR3s是否与其他HIR家族成员类似，能够诱导HR，参与植物对于病原菌的防御反应中。寄主植物为适应外界环境刺激，有效减少生物和非生物胁迫对自身的伤害，在长期演化过程中，通过对逆境信号的感知、信号传导和诱发各种防御基因表达，形成了一系列复杂且精细的HR信号传导机制。Ca2+离子、活性氧、多种激素及其他信号分子在HR的信号传导过程中发挥重要功能。水杨酸(Salicylicacid,SA)、茉莉酸(Jasmonicacid,JA)、乙烯(Ethylene,ETH)三类激素参与HR信号转导过程，在植物防御反应中的重要作用已获得广泛研究与应用。就目前来讲，关于HIR的研究主要集中在HIR1上，对HIRs在植物抵御细菌和真菌病原体侵染的作用研究较多。关于其他HIRs的功能研究还不多，也不清楚HIRs是否参与植物抗病毒侵染的过程。这就有必要发现或者筛选一些其它与抗病有关的基因，从而利用这些基因来制造抗病的植物，从而获得抗病的植株，减少化学农药的危害。
技术实现思路
水稻作为水稻条纹病毒的自然寄主，其OsHIR3与实验寄主本氏烟NbHIR3s序列高度同源(氨基酸同源性达80％)。我们发现RSV侵染诱导了水稻OsHIR3上调表达。我们成功克隆到日本晴水稻(OryzasativaL.spp.japonica.cv.Nipponbare)的OsHIR3基因，构建瞬时表达载体。经过水稻成熟胚诱导法将上述基因在水稻体内成功超表达，转OsHIR3基因水稻的种子发芽、植株幼苗生长、株高、结实情况与野生型日本晴水稻相比无明显差异。利用带毒灰飞虱对野生型和转基因水稻植株进行平行饲毒处理，发现转OsHIR3基因水稻植株在RSV侵染后，症状减轻，植株矮化缓解，感病植株仅表现条纹表型，感病植株叶片上RSVRNAs显著减少。由此，我们认为OsHIR3赋予水稻对RSV的耐病性。此外，转OsHIR3基因水稻植株接种水稻重要的细菌性病原黄单胞水稻变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)，转OsHIR3基因水稻植株叶片全病斑长度明显短于野生型，说明转OsHIR3基因水稻植株增强对Xoo的抗性。综上，OsHIR3赋予水稻对RSV和Xoo的基础抗性。因而，本专利技术将水稻OsHIR3植物体内超表达，并通过抗性鉴定获得耐RSV和Xoo的具有基础抗性的转基因水稻，这是首次将HIR3基因作为一种具有基础抗性的基因用于转基因耐病毒水稻创制。本专利技术的第一个目的是提供水稻OsHIR3基因。本专利技术的第二个目的是提供上述基因的用途。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下技术方案：日本晴水稻(OryzasativaL.spp.japonica.cv.Nipponbare)中存在6个HIR家族基因，序列分析表明，除了Os06g0136000属于HIR3家族，基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示，其他均属于HIR1家族。上述基因序列是利用引物，以水稻cDNA为模版，通过普通PCR扩增而来。为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用了以下技术方案：将上述OsHIR3构建到植物双元表达载体pCV1300，命名为pCV:OsHIR3，电击导入农杆菌菌株EHA105。通过水稻成熟胚诱导法获得过表达OsHIR3的转基因水稻。对上述转基因植物进行RSV的接毒鉴定，获得耐受RSV的转基因水稻。对上述转基因植物进行Xoo的接种鉴定，获得具基础抗性的转基因水稻。本专利技术获取的转OsHIR3基因水稻，主要应用于植物RSV和Xoo侵染，减轻病毒及细菌病害的为害。本专利技术对培育具基础抗性的转基因植物具有重要的理论及实际意义，对植物病害防治其他领域也有指导作用。与通过其他抗病毒策略获得的抗性株系相比，本专利技术的最主要优势是OsHIR3基因是植物体本身存在的基因，相对于其他病毒来源的抗性基因或片断，具有明显的安全性；转OsHIR3基因水稻对病毒和细菌病害具有基础抗性，抗性更广。附图说明图1.1：含有OsHIR3基因的表达载体图谱图1.2：插入质粒pCV-eGFP-N1载体图谱。图2：转OsHIR3基因水稻的分子生物学检测图3：转OsHIR3基因水稻的发育表型图4：转OsHIR3基因水稻抗RSV分析图5：转OsHIR3基因水稻抗Xoo分析图6：OsHIR3介导的基础抗性的调控机理探究。图7为OsHIR3基因序列图。具体实施方式需要说明的是，本实施方式仅仅以举例的方式来说明我们发现的基因的新的功能。通过对模式植物本氏烟上的验证了本专利技术的有效性，并不认为是对本专利技术的限制实施例1：OsHIR3基因的克隆本专利技术所转植物为日本晴水稻。1.重组农杆菌的获得1)OsHIR3基因的克隆利用引物OsHIR3-ORF-f和OsHIR3-ORF-r，以日本晴水稻cDNA为模版，通过普通PCR扩增而来。上述基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。克隆引物如下：OsHIR3-ORF-f:5'-ATGGTGAGCGCCTTCTTCCTGCT-3'(SEQIDNO：2)OsHIR3-ORF-r:5'-TTACACGTTGCTGCAGGACGCTT-3'(SEQIDNO：3)Trizol方法抽提植物总RNA：为避免RNA降解，RNA抽提过程需佩戴口罩和手套。1.取适量样品于含钢珠的进口2mLEppendorf(EP)管中，经液氮速冻后迅速于碾磨仪上18rps(RevolutionsPerSecond，转/秒)震荡30s-1min，充分研磨后加入适量Trizol(1mL/100mg样品，以确保样品充分裂解)，剧烈振荡混匀，冰上放置5min(利于核酸蛋白质复合体的解离)。4℃，13,000rpm离心10min。2.取上清于新的2mLEP管中，加入1/5体积氯仿，剧烈震荡30s，充分混匀，冰上静置2～3min。4℃，13,000rpm离心30min。3.EP管最上层是含RNA的无色水相，中层白色层为蛋白相，底层为氯仿本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.水稻
【技术特征摘要】
1.水稻OsHIR3基因在制备植物防御病毒或者细菌侵染危害上的用途。2.根据权利要求1所述的用途，所述的OsHIR3基因为SEQIDNO：1所示的序列。3.根据权利要求1所述的用途，所述的病毒为RSV;细菌为Xoo。4.根据权利要求1所述的用途，所述的水稻OsHIR3基因来自日本晴水稻。5.一种获得水稻转基因植物的方法，该方法包括：水稻OsHIR3基因构建到植物双元表达载体中，通过电击导入农杆菌菌株；通过水稻成熟胚诱导法获得过表达OsHIR3的转基因水稻。6.根据权利要求5所述的方法，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：燕飞，李赛赛，鲁宇文，赵晋平，彭杰军，郑红英，林林，程晔，陈剑平，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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