本发明专利技术公开了野生毛葡萄抗病基因及其应用，其完整开放阅读框序列全长1095bp，编码364个氨基酸。并构建了pCAMBIA2300‑35S‑VqWRKY52过量表达载体，通过花絮浸染法导入模式植物拟南芥，在拟南芥中过量表达明显提高了拟南芥对于活体寄生的白粉菌和丁香假单胞菌的抗性，降低了对腐生灰霉菌的抗性。野生毛葡萄商‑24抗病基因VqWRKY52参与SA介导的抗病信号途径并能够增强过敏反应，可用于提高植株的抗活体寄生真菌白粉菌和丁香假单胞菌能力及通过调控VqWRKY52基因的表达起到调控植物过敏反应，进而达到调控植物对不同病原菌的反应。
Disease resistance gene of wild grape and its application
The invention discloses a wild hair grape disease resistance gene and the application thereof, wherein the full-length open reading frame sequence is 1095bp, which encodes 364 amino acids. And the construction of the pCAMBIA2300 35S VqWRKY52 overexpression vector, by impregnation method into Arabidopsis tidbits, overexpression in Arabidopsis significantly enhanced resistance to powdery mildew and Arabidopsis Pseudomonas syringae living parasites, reduced resistance to Botrytis cinerea saprophytism. Taking 24 wild grape resistance gene VqWRKY52 involved in disease resistance signaling pathways mediated by SA and can enhance the allergic reaction, can be used to improve plant resistance to powdery mildew and parasitic fungi in Pseudomonas syringae and regulate the gene expression of VqWRKY52 to regulate plant allergic reaction, thereby regulating plant reaction to different pathogens.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物抗病基因鉴定及基因工程
，特别涉及一种野生毛葡萄抗病基因及其应用。
技术介绍
植物不像动物有移动的防卫细胞和后天的免疫系统，植物免疫系统只能依靠每个植物细胞以及由侵染位点释放出的信号。植物病原菌在与植物长期的进化过程中，进化出了多种多样的生活策略来帮助自己侵染植物，而形成了一套自己特有的免疫系统，其中转录因子在其中起着非常重要的调控作用。WRKY转录因子是其中比较重要的一类转录因子，在植物整个免疫体系网络中起着正调控或起着负调控的作用。WRKY转录因子是在植物中发现的特有转录调控因子，其蛋白质N端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和CX4-5CXNHXH/C(X为任一氨基酸)的锌指(Zinc-fingertype)结构，下游通过特异的结合靶基因启动子区域W盒(T)TGACC(A/T)核苷酸序列，从而调控相应基因的表达，发挥其分子生物学功能。WRKY转录因子分类是依据转录因子中所含结构域的个数和锌指结构，一般WRKY转录因子可分为三大类：第1类含有2个WRKY保守结构域，锌指结构类型为C2H2型；第2类只含有1个WRKY保守结构域，其锌指结构也为C2H2型；第3类与第2类相同，只含有1个WRKY保守结构域，但其锌指结构为C2HC型。在拟南芥和水稻中已有大量的研究表明WRKY转录因子在抗病中的作用，大多数的WRKY转录因子都是诱导型表达。一般WRKY转录因子上游受MAPK信号途径中的蛋白激酶MAPK磷酸化激活，下游可特异性的与W-box结合，进而刺激相关抗病基因的表达，产生抗病性反应；一种可以直接受病原菌诱导产生蛋白，多为病原菌所产生的效应因子，使WRKY蛋白表达量提高，WRKY基因再调控相关抗病基因，从而提高植物的抗病性，如AtWRKY70和AtWRKY18就是通过这种调节方式来提高拟南芥的抗病能力；多个WRKY转录因子之间也可以通过相互作用来调节植物对病原菌的抵抗能力，AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60的三突变体相比单突变体增加了对丁香假单胞菌抗性，但对番茄灰霉病表现抗性减弱。水稻OsWRKY23基因在拟南芥中超表达可以提高病程相关蛋白表达量，提高对丁香假单胞菌的抗性。植物抵抗病原菌侵染主要依赖两大类植物激素信号途径，其中，SA信号途径主要介导植物对活体寄生真菌的抗性，例如白粉菌等；JA/ET信号途径主要参与调控植物对腐生菌的抗性，例如灰霉菌等。植物激素在调控植物免疫时往往与其他响应元素一起作用，例如过敏反应和活性氧爆发。过敏反应与植物抗病密切相关，在活体寄生的真菌侵染植物时，植物会在侵染位点形成大面积的细胞死亡，以阻止真菌从植物获得营养，这将有利于限制真菌的生长，从而提高植株的抗病性。SA信号途径往往能在侵染位点或远端组织激发过敏反应，同时激活抗病相关蛋白的表达，激活系统获得性抗性。植物响应病原菌反应，往往伴随着活性氧爆发，活性氧在过敏反应中起重要作用。在模式植物拟南芥中抗病相关WRKY转录因子研究比较多，葡萄上关于的研究还不WRKY转绿因子的抗病功能研究还不是很多。我国拥有丰富的野生葡萄资源，其中的一些种和株系抗病性很强，例如商-24(S-24)但其品质不如欧洲葡萄种。通过取长补短，将野生葡萄抗病与欧洲葡萄的优良品质结合，对于研究和利用这些资源进行葡萄抗病育种具有重要的意义。因此，从中国野生葡萄中发掘抗病相关的基因并研究其抗病功能，了解其抗病反应的调控机理，寻找其抗病反应关键基因，并通过遗传转化改良感病品种，从而获得性状优良的理想品种。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种野生毛葡萄抗病基因，并验证了该野生毛葡萄抗病基因的抗病方面的功能及其可能的作用机制。为了实现上述任务，本专利技术采用如下的技术解决方案：一种野生毛葡萄抗病基因，其特征在于，该野生毛葡萄抗病基因为野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52，其编码区序列如下：经申请人进一步研究表明，该野生毛葡萄抗病基因可以用于提高植株的抗活体寄生真菌白粉菌和丁香假单胞菌能力。并通过调控VqWRKY52基因的表达起到调控植物过敏，进而达到调控植物对不同病原菌的反应。本专利技术给出的野生毛葡萄抗病基因，是首次从野生毛葡萄(Vitis.quinquangularis)商-24中克隆到的WRKY家族一个野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52，并进一步研究了该野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52的抗病方面的功能及其可能的作用机制，为葡萄及其它作物抗病育种提供理论依据。申请人首次构建了pCAMBIA2300-35S-VqWRKY52过量表达载体，并通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。研究了野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52过量表达的转基因株系和野生对照在接种白粉病，丁香假单胞杆菌和灰霉菌后，各种株系的抗病反应。根据申请人的进一步研究表明，野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52能明显提高拟南芥对白粉病和丁香假单胞杆菌的抗性，增加对灰霉菌的感病性。在三种病原菌侵染条件下，转基因株系中的活性氧(ROS)的积累明显高于野生对照，且转基因株系均出现强烈的过敏反应，对于活体寄生白粉菌和半活体寄生丁香假单胞杆菌来说，强烈的过敏反应限制病原菌生长，从而增强可对它们的抗病性，但对于腐生菌灰霉菌来说，强烈的过敏反应反而有利于其侵染，所以转基因株系对其抗性降低。以上结果都表明野生毛葡萄商-24抗逆基因VqWRKY52在拟南芥中的过量表达增强了植物过敏反应，提高了植株的抗活体寄生真菌的能力，降低了抗腐生菌的能力。附图说明图1是野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52对SA和JA的响应。其中，A图是用qRT-PCR方法看野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52的相对表达量，图B是野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52启动子活性分析，*表示与对照相比有显著差异，**表示与对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05，**P<0.01)。图2是野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52启动子在拟南芥T3代植株中不同生长阶段的表达模式情况；其中，A图为生长在MS培养基24小时的成熟胚，标尺为200μm；B图为5天龄的幼苗，标尺为500μm；C图为2周龄的苗子，标尺为2mm；D图为3周龄苗子；E图为花絮，标尺为2mm；F图为花，标尺为1mm；G图为花的花柱和花药，标尺为200μm；H图为角果，标尺为1mm。图3是野生对照，pad4突变体，转基因株系VqWRKY52(#28)，VqWRKY52(#30)和VqWRKY52(#33)的盆栽苗接种白粉菌的反应。其中，A图为各株系接种白粉后7天的形态学照片；B图为台盼兰染色观察白粉菌诱导的植物细胞死亡，图上标尺代表200μm。图4是野生对照，pad4突变体，转基因株系VqWRKY52(#28)，VqWRKY52(#30)和VqWRKY52(#33)的盆栽苗接种白粉菌后菌落生长与活性氧的积累。其中，A图是接种七天后台盼兰染色观察白粉菌菌体生长和植物细胞死亡，箭头指出的是白粉菌诱导的植物细胞死亡，图上标尺代表100μm；B图是用NBT对O2-染色看在接种后0小时，24小时，48小时，和72小时后的积累，图上标尺代表2cm；C图是接种七天后分生孢子数统本文档来自技高网...
【技术保护点】
野生毛葡萄抗病基因，其特征在于，该野生毛葡萄抗病基因为野生毛葡萄商‑24抗病基因VqWRKY52，其编码区序列如下：
【技术特征摘要】
1.野生毛葡萄抗病基因，其特征在于，该野生毛葡萄抗病基因为野生毛葡萄商-24抗病基因VqWRKY52，其编码区序列如下：2.权利要求1所述的野生毛葡萄抗病基因用于提高植株的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王西平，王现行，涂明星，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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