一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具技术

本发明专利技术公开了一种在‑80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具。其中，方法包括S1、将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min；S2、首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液、间隔空气柱和混合有胚胎的保存液等；S3、将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，再将麦管传热容器置于盛装有乙醇溶液的真空保温容器中，使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；S4、将真空保温容器迅速放置于‑80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。本发明专利技术通过对保存处理液的成分及配比的改进和利用及优化保存方法步骤形成了一种全新地且适用于将玻璃化冷冻胚胎保存于‑80摄氏度的冰箱中的模式，方便在实验室内对胚胎进行便捷的取用、操作及移植。

A method and apparatus for preserving vitrified frozen embryos in - 80 degree refrigerator

The invention discloses a method and apparatus for preserving vitrified frozen embryos in 80 degree refrigerator. Among them, the methods include S1, putting the embryos in the equilibrium solution for at least 2 minutes, taking them out and transferring them to the preservation solution for at least 1 minute; S2, putting sucrose culture solution, air column and embryonic preservation solution into the sterile wheat tube first; S3, encapsulating the sterile wheat tube sealed in the wheat tube heat transfer container, and then putting the wheat tube heat transfer container in the sterile wheat tube heat transfer container filled with B. In the vacuum heat preservation container of alcohol solution, the wheat tube heat transfer container is located in the liquid level of alcohol solution; in S4, the vacuum heat preservation container is quickly placed in the refrigerator of 80 degrees Celsius to complete the preservation of frozen embryos. By improving and utilizing the composition and proportion of the preservation treatment solution and optimizing the preservation method steps, the invention forms a completely new mode suitable for storing vitrified frozen embryos in a refrigerator of 80 degrees Celsius, which facilitates convenient fetching, operation and transplantation of embryos in the laboratory.

【技术实现步骤摘要】
一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具
本专利技术涉及生物工程
，尤其是一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具。
技术介绍
辅助生殖技术是一种集胚胎分割、嵌合、移植、体外受精、转基因等技术于一体的综合性技术，不但是动物繁殖领域的重要技术革命，也是治疗人类不孕不育的重要技术手段，利用此技术可以充分挖掘动物的遗传和繁殖能力、增加纯种家畜和优秀个体的后代数量、缩短家畜的改良周期以及保存具有优良遗传特性的胚胎和基因，在生物学及医学领域的被广泛地研究和应用。近些年来，人类不孕不育已经成为继癌症、心血管病之后的第三大疾病。部分患者不得不借助于人类辅助生殖技术来解决生育问题，还有部分肿瘤患者非常需要在癌症治疗之前保留生育能力，经济动物胚胎的胚胎移植以及重要物种的种质资源保存等等。目前，业内最常用的胚胎保存方法是玻璃化保存方法，所谓的玻璃化保存方法即是指将胚胎置于高浓度的保存液中进行短时间处理，然后再快速移放于液氮中进行冷冻保存的方法。而通过玻璃化保存方法来保存的胚胎，其细胞内外的水分不会形成结晶，使细胞结构不会受到破坏而得以存活；这种方法操作简单，因此获得了广泛的应用。然而，此方法存在的一个最大缺陷在于：冷冻保存的胚胎必须放在液氮温度中才能维持胚胎复苏后的成活率，这给胚胎的解冻和运输都带来了严格的要求，无法满足胚胎移植及实验研究的需要。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法；本专利技术的第二个目的在于提供一种适用于此方法的保存玻璃化冷冻胚胎的器具。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，它包括以下步骤：S1、胚胎预处理：将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液由0.3mol/kg磷酸缓冲盐溶液、11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；S2、胚胎入管：按一定长度首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液，然后间隔地且顺序地置入间隔空气柱和混合有胚胎的保存液，最后将无菌麦管的两个端口作密封处理；S3、胚胎预冷冻：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，随后再将麦管传热容器置于真空保温容器中，最后将乙醇溶液填充于真空保温容器内并使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；S4、胚胎保存：将真空保温容器迅速放置于-80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。优选地，在完成步骤2后并执行步骤3之前的期间内，将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理。优选地，在步骤S2中，对容积为0.25ML的麦管作紫外线照射消毒处理以获得无菌麦管，置入的混合有胚胎的保存液的长度为2cm。优选地，预先将麦管传热容器和盛装有乙醇溶液的真空保温容器置于-80摄氏度的冰箱中作冷冻平衡处理，冷冻平衡处理时间不少于24h。一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的器具，它包括真空保温容器、盛装于真空保温容器内的乙醇溶液、置于真空保温容器内并位于乙醇溶液的液面内的麦管传热容器以及封装于麦管传热容器内且内部填充有胚胎的无菌麦管，所述无菌麦管的两个端口作密封处理。优选地，所述麦管传热容器为由铝合金材料制成的圆筒状结构体。优选地，所述无菌麦管内形成有经填充蔗糖培养液所形成的营养液段、经填充空气所形成的间隔空气段以及经填充保存液所形成以用于混合胚胎的保存液段，所述保存液段位于相邻的两个间隔空气段之间，且所述营养液段与间隔空气段相邻并位于无菌麦管的至少一端。优选地，所述保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成。由于采用了上述方案，本专利技术实施例通过对保存处理液的成分及配比的改进和利用以及优化保存方法步骤，形成了一种全新地且适用于将玻璃化冷冻胚胎保存于-80摄氏度的冰箱中的模式，一方面能够使胚胎在保存的过程中处于稳定的状态，减轻胚胎在冷冻过程中其内部的过冷化程度，从而获得相比于传统方式相同或者更加稳定的成活率，另一方面使胚胎可以被暂存于冰箱中，避免因利用液氮进行保存而产生的保存标准要求高、繁琐不便等系列问题，方便在实验室内对胚胎进行便捷的取用、操作及移植。附图说明图1是本专利技术实施例的保存器具的截面结构示意图；图2是本专利技术实施例的无菌麦管的内部填充物分布示意图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的实施例进行详细说明，但是本专利技术可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。本实施例提供的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，它包括以下步骤：S1、胚胎预处理：准备一份平衡液和两份保存液，将获取的胚胎(包括但不限于如自然胚胎、体外受精胚胎、克隆胚胎等)置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于其中一份保存液处理至少1min(此时另一份保存液最好置于-80摄氏度的冰箱中进行暂存)，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液由0.3mol/kg磷酸缓冲盐溶液(即：PBS溶液(PhosphateBufferSaline))、11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；S2、胚胎入管：如图1所示，将经步骤S1处理的胚胎浸入另一份保存液中，按一定长度首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液，然后间隔地且顺序地置入间隔空气柱和混合有胚胎的保存液(其与步骤S1中所使用的保存液的成分比例相同，并且最好在3min之内入管)，最后将无菌麦管的两个端口作密封处理；在具体实施时，可将上述材料吸入的一端用密封塞塞住、相对端则可利用酒精等加热后作热压封口处理)，从而不但可以利用位于胚胎两侧的空气和蔗糖培养液实现对胚胎的隔离，而且保证胚胎具有充足的营养和气体供给；S3、胚胎预冷冻：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器(其可根据实际情况采用具有良好导热性能的材料制作而成)内，随后再将麦管传热容器置于真空保温容器中，最后将乙醇溶液填充于真空保温容器内并使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内(所述及的液面内即是指液面下或者处于乙醇溶液的浸泡状态下)；S4、胚胎保存：将真空保温容器迅速放置于-80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。基于现有的玻璃化保存方法仅能使用液氮来实现，而不便于对冷冻胚胎进行灵活、便捷地保存的现状，本专利技术实施例通过对保存处理液的成分及配比的改进和利用以及优化保存方法步骤，形成了一种全新地且适用于将玻璃化冷冻胚胎保存于-80摄氏度的冰箱中的模式，利用以PBS溶液为基础液并通过将乙二醇、蔗糖、聚蔗糖等成分溶解为一体所形成的平衡液对胚胎进行预处理，可利用乙二醇在低浓度时候的低毒性的特性，在较长的处理时间内使乙二醇充分渗透至胚胎内部以形成对胚胎的内部保护，而利用蔗糖和聚蔗糖在平衡液中所起到的促进胚胎脱水的作用，来降低胚胎内部的水分含量；利用保存液所具有的高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在‑80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，其特征在于：它包括以下步骤：S1、胚胎预处理：将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液由0.3mol/kg磷酸缓冲盐溶液、11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；S2、胚胎入管：按一定长度首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液，然后间隔地且顺序地置入间隔空气柱和混合有胚胎的保存液，最后将无菌麦管的两个端口作密封处理；S3、胚胎预冷冻：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，随后再将麦管传热容器置于真空保温容器中，最后将乙醇溶液填充于真空保温容器内并使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；S4、胚胎保存：将真空保温容器迅速放置于‑80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。

【技术特征摘要】
1.一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，其特征在于：它包括以下步骤：S1、胚胎预处理：将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液由0.3mol/kg磷酸缓冲盐溶液、11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；S2、胚胎入管：按一定长度首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液，然后间隔地且顺序地置入间隔空气柱和混合有胚胎的保存液，最后将无菌麦管的两个端口作密封处理；S3、胚胎预冷冻：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，随后再将麦管传热容器置于真空保温容器中，最后将乙醇溶液填充于真空保温容器内并使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；S4、胚胎保存：将真空保温容器迅速放置于-80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。2.如权利要求1所述的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，其特征在于：在完成步骤2后并执行步骤3之前的期间内，将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理。3.如权利要求1所述的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，其特征在于：在步骤S2中，对容积为0.25ML的麦管作紫外线照...

【专利技术属性】
技术研发人员：金波，刘湘娟，
申请(专利权)人：力盟低温医学深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44