一种在冷藏温度-5℃至0℃下保存运输胚胎的方法技术

本发明专利技术公开了一种在冷藏温度‑5℃至0℃下保存运输胚胎的方法。它包括S1、将保存液封装于低温冷冻管中，按配置100ml的保存液计，保存液以磷酸盐缓冲液为基础液由0.8mol/kg蔗糖和3mg/ml牛血清白蛋白混合而成；S2、将含有2细胞期胚胎的输卵管从动物体内摘出后，对输卵管的两端进行热封处理；S3、首先将经热封处理的输卵管快速置于低温冷冻管中的保存液内，随后在将低温冷冻管作端口封闭处理后快速浸入于内部温度为‑5℃至0℃的真空保温容器中；S4、在48h内将真空容器运至目的地。本发明专利技术通过对保存液的成分及其配比、冷藏温度以及系列处理步骤的掌控，可以简单快捷且经济适用的在‑5℃至0℃状态下运输新鲜的胚胎，并保持胚胎具有足够高的成活率以及胚胎移植后的活产率。

A method of preserving and transporting embryos at refrigeration temperatures ranging from - 5 C to 0 C

The present invention discloses a method for preserving and transporting embryos at refrigeration temperature It includes S1, encapsulating the preservation solution in a cryogenic cryogenic tube, according to the configuration of 100 ml of preservation liquid meter, the preservation solution is based on phosphate buffer, which is composed of 0.8 mol/kg sucrose and 3 mg/ml bovine serum albumin; S2, after removing the oviduct containing 2-cell embryo from the animal body, heat-seal the two ends of the oviduct; S3, first, heat-seal the oviduct quickly. Place the cryogenic tube in the preservation solution, then quickly immerse the cryogenic tube in the vacuum heat preservation container whose internal temperature is from By controlling the composition and proportion of the preservation solution, the refrigeration temperature and a series of processing steps, the invention can transport fresh embryos at 5 to C economically and quickly, and keep the survival rate of embryos high enough and the survival rate after embryo transfer.

【技术实现步骤摘要】
一种在冷藏温度-5℃至0℃下保存运输胚胎的方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其是一种在冷藏温度-5℃至0℃下保存运输胚胎的方法。
技术介绍
动物胚胎的获取工作通常是在实验室内进行的，而胚胎移植过程则通常是在养殖场内(或其他专用实验室内)进行的；因此，在胚胎生产后到移植前的这段周期内，则会存在一个对胚胎进行临时保存和运输的过程，而此过程往往会对胚胎在受体动物体内的发育以及妊娠率起到至关重要的影响。自1949年Polge等人发现在精液冷冻稀释液中加入保护剂——甘油可以起到降低低温冷冻过程对精子的损害的特殊保护作用开始，直到1972年Mazur等人建立了低温保存的理论体系，并且利用低温保存技术在世界上第一次成功地保存了小鼠的胚胎，低温保存技术才得以被推广应用。而低温保存技术在胚胎冷冻过程中的应用主要是将生物胚胎置于液氮温度(-196摄氏度)内进行长时间存储，其不但可以避免原微生物感染的问题，而且结合胚胎移植技术可以使胚胎的运输相较于生物活体运输更容易，从而也为保存运输重要遗传资源动物胚胎提供了全面的保障。然而，针对胚胎的低温保存技术目前大多只能依靠液氮的低温来实现，为了运输冷冻的胚胎，只能通过含有液氮的运输罐进行运输。液氮运输罐本身价格昂贵，而且运输过程胚胎必须依靠液氮来维持低温状态，在胚胎运输到目的地后还需要返还空置的液氮运输罐，不但操作极为繁琐，而且运输及保存的费用极为高昂；显然，这对于研究单位或生产单位转移重要的遗传资源来讲是无奈之举。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种在冷藏温度-5℃至0℃下保存运输胚胎的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种在冷藏温度-5℃至0℃下保存运输胚胎的方法，它包括以下步骤：S1、保存液入管：首先，将保存液封装于低温冷冻管中，然后再将低温冷冻管置于-5℃至0℃的环境中作平衡冷冻保存；其中，按配置100ml的保存液计，保存液以磷酸盐缓冲液为基础液由0.8mol/kg蔗糖和3mg/ml牛血清白蛋白混合而成，保存液的用量与低温冷冻管的容积之间的比值为1:1.8；S2、获取胚胎：将含有2细胞期胚胎的输卵管从动物体内摘出后，对输卵管的两端进行热封处理；S3、胚胎入管：首先将经热封处理的输卵管快速置于低温冷冻管中的保存液内，随后在将低温冷冻管作端口封闭处理后快速浸入于内部温度为-5℃至0℃的真空保温容器中；S4、胚胎运输：在48h内将真空容器运至目的地，然后回收胚胎作后续保存或利用。优选地，在步骤S1中，将低温冷冻管置于0℃的冰水中进行至少10min的平衡保存处理。优选地，在步骤S3中，首先将经热封处理的输卵管快速置于低温冷冻管中的保存液内，然后对低温冷冻管作端口封闭处理后将低温冷冻管封装于塑料薄膜袋中，最后将塑料薄膜袋快速浸入含有0℃冰水的真空保温容器中。优选地，在步骤S2中，利用经酒精加热的镊子对输卵管的两端作热封处理。由于采用了上述方案，本专利技术通过对保存液的成分及其配比、冷藏温度以及系列处理步骤的掌控，可以简单快捷且经济适用的在-5℃至0℃状态下运输新鲜的胚胎，并保持胚胎具有足够高的成活率以及胚胎移植后的活产率，规避传统运输胚胎方式要么通过液氮系统或者通过专用的胚胎运输设备才能完成，而导致的操作繁琐、运输成本昂贵的问题。附图说明图1是本专利技术实施例对装载有胚胎的输卵管的两端作密封处理的示意图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的实施例进行详细说明，但是本专利技术可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。本专利技术实施例提供的一种在冷藏温度-5℃至0℃下保存运输胚胎的方法，它包括以下步骤：S1、保存液入管：首先，将保存液封装于低温冷冻管中，然后再将低温冷冻管置于-5℃至0℃的环境中作平衡冷冻保存；其中，按配置100ml的保存液计，保存液以磷酸盐缓冲液为基础液由0.8mol/kg蔗糖和3mg/ml牛血清白蛋白(即：BAS，BovineSerumAlbumin)混合而成，保存液的用量与低温冷冻管的容积之间的比值为1:1.8(如1.8ml的低温冷冻管中放入1ml保存液)；S2、获取胚胎：将含有2细胞期胚胎的输卵管从动物体内摘出后，利用经酒精加热的镊子对输卵管的两端进行热封处理(图1示出了对装载有胚胎的输卵管的两端作密封处理的示意图)；S3、胚胎入管：首先将经热封处理的输卵管快速置于低温冷冻管中的保存液内，随后在将低温冷冻管作端口封闭处理后快速浸入于内部温度为-5℃至0℃的真空保温容器中；S4、胚胎运输：在48h内将真空容器运至目的地，然后回收胚胎作后续保存或利用。基于常规的胚胎保存及运输方法所存在的缺陷，本实施例提供了一种能够在冷藏温度为-5℃至0℃(尤其是0℃)下对重要遗传资源动物胚胎进行临时保存及运输的方法，其利用2细胞期胚胎作为一个最好的运输胚胎的阶段的特性，可通过直接从动物体内回收输卵管的方式来获取胚胎，而以输卵管作为胚胎的运输载体则可有效降低冷藏运输过程中因振荡而对胚胎产生的伤害；同时，胚胎在-5℃至0℃的蔗糖保存液中脱水，可降低胚胎对冷藏过程中的低温敏感性；由此，通过对保存液的成分及其配比、冷藏温度以及系列处理步骤的掌控，利用此方法可以简单快捷且经济适用的在-5℃至0℃状态下运输新鲜的胚胎，并保持胚胎具有足够高的成活率以及胚胎移植后的活产率，规避传统运输胚胎方式要么通过液氮系统或者通过专用的胚胎运输设备才能完成，而导致的操作繁琐、运输成本昂贵的问题。作为优选方案，为增强整个方法在实施的过程中能够为胚胎创造相对平衡的温度环境，在步骤S1中，最好预先将低温冷冻管置于0℃的冰水中进行至少10min的平衡保存处理。由此，在将低温冷冻管置于真空保温容器中后，可保证胚胎不会发生剧烈或缓慢的温度变化，即保证胚胎的环境温度相对平衡并接近0℃的温度状态。在此基础上，作为另一优选方案，在步骤S3中，首先将经热封处理的输卵管快速置于低温冷冻管中的保存液内，然后对低温冷冻管作端口封闭处理后将低温冷冻管封装于塑料薄膜袋中，最后将塑料薄膜袋快速浸入含有0℃冰水的真空保温容器中。以此，利用塑料薄膜袋作为封装有胚胎的低温冷冻管的装载器具，可避免低温冷冻管与冰水混合物直接接触，以在低温冷冻管的周围形成相对均衡且密闭的冷冻保温层，使经由冰水环境所产生的冷量能够均匀地分布在低温冷冻管的周围，而利用真空保温容器则可为其内部的胚胎创造一个真空无菌的外部冷藏环境。作为优选方案，在步骤S2中，可根据实际情况利用诸如经酒精加热的镊子对输卵管的两端作热封处理；通过对输卵管的两端作封闭处理可阻止保存液直接进入输卵管内，从而避免胚胎间相互黏连而影响胚胎的后续发育。为对本实施例的方法进行可实施性的充分验证并充分体现出其有益效果，以ICR品系和C57BL/J品系的小鼠2细胞期胚胎作为实验对象，在处于新鲜状态下和利用本实施例的保存液及处理方法(0℃)为对比对象；小鼠胚胎的成活率以及移植的活产率详见表一和表二。从表一所显示的实施结果来看，使用本实施例的方法，2细胞期胚回收后并经过48小时的零度冷藏运输后，其形态正常的成活率93％(ICR品系)、90％(C57BL/J品系)跟新鲜的胚胎几乎没有区别，继续培养发育到囊胚的成活率达到85％(ICR品系)、88％(C57BL/J品系)，与新鲜胚胎本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在冷藏温度‑5℃至0℃下保存运输胚胎的方法，其特征在于：它包括以下步骤：S1、保存液入管：首先，将保存液封装于低温冷冻管中，然后再将低温冷冻管置于‑5℃至0℃的环境中作平衡冷冻保存；其中，按配置100ml的保存液计，保存液以磷酸盐缓冲液为基础液由0.8mol/kg蔗糖和3mg/ml牛血清白蛋白混合而成，保存液的用量与低温冷冻管的容积之间的比值为1:1.8；S2、获取胚胎：将含有2细胞期胚胎的输卵管从动物体内摘出后，对输卵管的两端进行热封处理；S3、胚胎入管：首先将经热封处理的输卵管快速置于低温冷冻管中的保存液内，随后在将低温冷冻管作端口封闭处理后快速浸入于内部温度为‑5℃至0℃的真空保温容器中；S4、胚胎运输：在48h内将真空容器运至目的地，然后回收胚胎作后续保存或利用。

【技术特征摘要】
1.一种在冷藏温度-5℃至0℃下保存运输胚胎的方法，其特征在于：它包括以下步骤：S1、保存液入管：首先，将保存液封装于低温冷冻管中，然后再将低温冷冻管置于-5℃至0℃的环境中作平衡冷冻保存；其中，按配置100ml的保存液计，保存液以磷酸盐缓冲液为基础液由0.8mol/kg蔗糖和3mg/ml牛血清白蛋白混合而成，保存液的用量与低温冷冻管的容积之间的比值为1:1.8；S2、获取胚胎：将含有2细胞期胚胎的输卵管从动物体内摘出后，对输卵管的两端进行热封处理；S3、胚胎入管：首先将经热封处理的输卵管快速置于低温冷冻管中的保存液内，随后在将低温冷冻管作端口封闭处理后快速浸入于内部温度为-5℃至0℃的真空保温容器中；S4、胚胎运输：在...

【专利技术属性】
技术研发人员：金波，刘湘娟，
申请(专利权)人：力盟低温医学深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44