一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其方法技术

本发明专利技术属于生物医学检验领域，公开了一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其方法。所述检测试剂盒包括试剂1、试剂2和触发剂；所述试剂1包括吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体；所述试剂2包括辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体；所述触发剂包括过氧化氢和对羟基肉桂酸。本发明专利技术的试剂盒能够利用化学发光法实现完全均相测定氧化低密度脂蛋白，检测过程无需包被，无需洗涤分离，具有灵敏度高、准确度好、反应时间短的特点，结合仪器检测能够满足临床快速检测要求。

【技术实现步骤摘要】
一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其方法
本专利技术涉及生物医学检验领域，具体涉及一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的化学发光检测试剂盒及其方法。
技术介绍
天然的低密度脂蛋白(LDL)核心的脂肪酸中含有大量不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，PUFAs)，其约占LDL总脂肪酸含量的35％-70％，LDL中的PUFAs在自由基或其他氧化剂作用下，生成脂类自由基，并能产生更多的过氧化脂质，引起连锁的自由基链式反应，最终生成多种反应性的醛。这些化学性质活泼的醛和载脂蛋白B(ApoB)发生结合，产生新的抗原决定簇，形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。ox-LDL可以通过细胞毒性作用和化学趋化作用，影响血管平滑肌增殖，加速泡沫细胞形成，影响纤溶和凝血等机制促进动脉粥样硬化(As)的发生和发展。ox-LDL是As发生的强危险指标，并与冠心病的发生和发展密切相关。ox-LDL可致使巨噬细胞转化为泡沫细胞；As斑块中也可找到ox-LDL的存在。此外，ox-LDL可以转化为免疫原，诱发体内产生相应的抗体与ox-LDL形成抗原抗体复合物。ox-LDL由清道夫途径，在促进胆固醇的堆积和泡沫细胞形成的同时，释放出多种细胞因子等物质，这些物质可能破坏血管内皮细胞，诱导平滑肌细胞增殖，进一步加速As进程。目前氧化低密度脂蛋白抗原多是通过硫酸铜氧化LDL得到，保存条件仅能在2-8℃，冷冻后有明显的降解，且有效期约为6个星期。部分校准品冻干复溶后2-8℃仅能保持一周的稳定性。校准品的不稳定性极大地影响到检测试剂的稳定性和结果的准确性。目前氧化低密度脂蛋白常用的检测方法有：1)ELISA法，是目前测定ox-LDL特异性较好的检测方法；2)共轭双烯法，是一种较为广泛使用的反应LDL氧化易感性的检测方法；3)硫代巴比妥酸反应物化学测定法，该法基于化学原理测定ox-LDL；4)相对电泳迁移速率法，在脂质过氧化反应中，LDL上的卵磷脂在卵磷脂酶的作用下生成溶血卵磷脂和多聚不饱和脂肪酸，多聚不饱和脂肪酸在氧自由基的作用下生成脂质过氧化物，同时发生磷脂水解等反应使LDL结构发生变化，生成醛类物质与ApoB中的游离氨基结合导致其负电荷增加，表现在电泳迁移率加快；5)抗ox-LDL自身抗体测定法，通过检测抗ox-LDL自身抗体来间接反应ox-LDL水平。然而，目前的这些检测方法均存在灵敏度不高、操作复杂、反应时间长、检测结果不准确等缺点。相对于以上方法，化学发光法具有明显的优势，具有精确度高，无污染，检测速度快等优势。但目前还未开发ox-LDL的化学发光检测方法，且传统的化学发光本身存在一些缺陷，如需要包被、洗涤分离，操作复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其方法，该试剂盒属于化学发光法，具有化学发光检测方法的优势，同时无需包被，无需洗涤分离，反应快速，操作简便。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括试剂1、试剂2和触发剂；所述试剂1包括吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体；所述试剂2包括辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗载脂蛋白B抗体；所述触发剂包括过氧化氢和对羟基肉桂酸。本专利技术的检测试剂盒利用吖啶酯标记抗氧化低密度脂蛋白抗体、抗原、辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B(ApoB)抗体形成抗体-抗原-抗体复合物，无需洗涤过程，无需包被，加入触发剂后立即连续检测一段时间(通常是1-3s)，计算其峰面积，氧化低密度脂蛋白的含量与其峰面积成正相关。其检测原理为辣根过氧化物酶氧化触发剂中的过氧化氢和对羟基肉桂酸可产生自由基，自由基随即氧化抗氧化低密度脂蛋白抗体上的吖啶酯，由于自由基的半衰期非常短，只能在分子内中扩散，故只有形成抗体-抗原-抗体复合物才能反应发光。本专利技术的检测试剂盒灵敏度高、准确度好、反应时间短，结合仪器检测能够满足临床大批量快速检测的需求。作为本专利技术所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL；所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL。作为本专利技术所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1还包括还原剂1，所述还原剂1为硫代硫酸钠；所述试剂2还包括还原剂2和氧化酶，所述还原剂2为维生素C或还原型谷胱甘肽，所述氧化酶为EC氧化酶(ECOxyrase)。硫代硫酸钠的作用是为防止吖啶酯被氧化，维生素C或还原型谷胱甘肽可以防止自由基传递到相邻的抗原抗体复合物，有效地降低了本底；ECOxyrase可以除掉溶剂中氧，保护VC不被氧化，从而提高试剂的稳定性。作为本专利技术所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL和还原剂10.02-0.2w/v％；所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂20.02-0.1w/v％和氧化酶0.01-0.5w/v％。作为本专利技术所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体3μg/mL和还原剂10.1w/v％；所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体1μg/mL、还原剂20.05w/v％和氧化酶0.03w/v％作为本专利技术所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1还包括缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇和防腐剂；所述试剂2还包括缓冲液、甘露醇、聚乙二醇、酶稳定剂和防腐剂；所述试剂1包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL、还原剂10.02-0.2w/v％、BSA0.1-1w/v％、甘露醇0.1-1w/v％和防腐剂0.04％-0.1％；所述试剂2包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂20.02-0.1w/v％、氧化酶0.01-0.5w/v％、甘露醇0.2-1.5w/v％、聚乙二醇200000.1-1w/v％、酶稳定剂0.01-0.2w/v％和防腐剂0.04-0.1w/v％。甘露醇和BSA对抗体具有一定的保护作用，多元醇及酶稳定剂保护HRP标记抗体的稳定性；各组分联用有效地提高了试剂稳定性和信噪比。作为本专利技术所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂1包括下述浓度的组分：缓冲液30mM、吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体3μg/mL、还原剂10.1w/v％、BSA0.5w/v％、甘露醇0.5w/v％和防腐剂0.05％；所述试剂2包括下述浓度的组分：缓冲液30mM、辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体1μg/mL、还原剂20.05w/v％、氧化酶0.03w/v％、甘露醇0.5w/v％、聚乙二醇200000.5w/v％、酶稳定剂0.1w/v％和防腐剂0.05w/v％。作为本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂1、试剂2和触发剂；所述试剂1包括吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体；所述试剂2包括辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体；所述触发剂包括过氧化氢和对羟基肉桂酸。

【技术特征摘要】
1.一种完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂1、试剂2和触发剂；所述试剂1包括吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体；所述试剂2包括辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体；所述触发剂包括过氧化氢和对羟基肉桂酸。2.根据权利要求1所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1还包括还原剂1，所述还原剂1为硫代硫酸钠；所述试剂2还包括还原剂2和氧化酶，所述还原剂2为维生素C或还原型谷胱甘肽，所述氧化酶为EC氧化酶。3.根据权利要求2所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL和还原剂10.02-0.2w/v％；所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂20.02-0.1w/v％和EC氧化酶0.01-0.5w/v％；优选地，所述试剂1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体3μg/mL和还原剂10.1w/v％；所述试剂2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体1μg/mL、还原剂20.05w/v％和氧化酶0.03w/v％。4.根据权利要求1所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1还包括缓冲液、牛血清白蛋白、甘露醇和防腐剂；所述试剂2还包括缓冲液、甘露醇、聚乙二醇、酶稳定剂和防腐剂；所述试剂1包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白抗体1-5μg/mL、还原剂10.02-0.2w/v％、牛血清白蛋白0.1-1w/v％、甘露醇0.1-1w/v％和防腐剂0.04％-0.1％；所述试剂2包括下述浓度的组分：缓冲液5-100mM、辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B抗体0.5-2μg/mL、还原剂20.02-0.1w/v％、氧化酶0.01-0.5w/v％、甘露醇0.2-1.5w/v％、聚乙二醇200000.1-1w/v％、酶稳定剂0.01-0.2w/v％和防腐剂0.04-0.1w/v％。5.根据权利要求4所述的完全均相测定氧化低密度脂蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗宁，李民友，张玲，段朝晖，高国全，杨霞，
申请(专利权)人：广州市进德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44