一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血中N‑甲基氨甲酰加合物的快速检测方法，该方法包括以下步骤：样品的固相萃取处理；液相色谱‑串联质谱的建立；标准曲线的建立；样品测定。样品经固相萃取处理、高效液相色谱‑串联质谱技术分析，并采用内标法，在电喷雾离子源电离和多反应监测模式条件下进行测定。本发明专利技术的快速检测方法，具有快速、准确、灵敏、少污染、低成本的优点，适用于大量样品的准确快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法
本专利技术涉及医学
，具体来说，涉及一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法。
技术介绍
N-甲基氨甲酰加合物(N-methylcarbamoyladduct)是二甲基甲酰胺（DMF）在血中代谢物。DMF在我国医药化工等领域广泛使用，作业场所DMF主要经呼吸道及皮肤进入机体，对肺脏、肝脏及肾脏等器官造成损害，严重者可导致死亡。DMF已经成为中国工业中毒中常见的毒物之一。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，二甲基甲酰胺在2A类致癌物清单中。开展DMF生物标志物检测，对于预防和控制作业场所DMF中毒，保护劳动者的健康具有重要意义。由于人体血液红细胞更新时间长达4个月，N-甲基氨甲酰加合物一旦形成，在较长的时间内可维持相对稳定的水平，研究表明，DMF体内代谢产物异氰酸甲酯与血红蛋白相互作用形成的N-甲基氨甲酰加合物，可作为反映DMF职业暴露水平的生物标志物。血液中N-甲基氨甲酰加合物的检测，可通过埃德曼降解法，将加合物降解为3-甲基-异丙基乙内酸脲(3-methyl-5-isopropylhydantoin)，运用气相色谱-质谱法、气相色谱法进行测定。现有气相色谱-质谱法、气相色谱法处理过程繁琐，定性可靠性差，灵敏度低，耗时长，污染重，成本高。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法，包括以下步骤：S1.样品的处理S11.用肝素抗凝的采血管收集血样1-10mL，离心弃去血浆，裂解红细胞，再加入丙酮溶液（含有2%的浓盐酸），沉降离心弃上清液，清洗并干燥，得到血红蛋白；S12.准确称取0.01-0.2g的血红蛋白置于离心管中，加入3-甲基-异丁基海因内标溶液，再加入盐酸-醋酸(2:1，V/V)溶液后进行降解，将降解后的溶液进行净化处理得到待测样液，再将待测样液转移到样品瓶中待测；S13.向另一离心管加入3-甲基-异丁基海因内标溶液，再加入盐酸-醋酸(2:1，V/V)溶液后进行降解，将降解后的溶液进行净化处理得到空白样液，再将空白样液转移到样品瓶中待测；S2液相色谱-串联质谱的建立色谱条件：色谱柱：C18色谱柱；质谱条件：电离方式：电喷雾离子源（ESI+）；多反应监测模式：3-甲基-异丙基乙内酸脲监测72.0/157.1(定量)，129.1/157.1；3-甲基-异丁基海因监测86.0/171.1；S3.标准曲线的建立将3-甲基-异丙基乙内酸脲标准系列工作液和内标物3-甲基-异丁基海因进行测定，以3-甲基-异丙基乙内酸脲与内标3-甲基-异丁基海因的峰面积比值为纵坐标，以3-甲基-异丙基乙内酸脲标准系列工作液浓度为横坐标绘制标准曲线；S4.样品测定将所述待测样液和所述空白样液依次测定进样，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到测定液中3-甲基-异丙基乙内酸脲的浓度，并得到样品中N-甲基氨甲酰加合物的浓度。进一步的，所述步骤S11中所述裂解红细胞为先用生理盐水清洗红细胞，再用蒸馏水在超声状态下裂解。进一步的，所述步骤S11中所述干燥方法为氮气吹干或减压烘箱中30-65℃干燥。进一步的，所述步骤S12和步骤S13中所述3-甲基-异丁基海因内标溶液的浓度为40nmol/mL，所述3-甲基-异丁基海因内标溶液的体积为250μL，所述盐酸-醋酸(2:1，V/V)溶液的体积为4.75mL。进一步的，所述步骤S12和步骤S13中所述降解中将离心管置于70-100℃水浴中加热降解1h，所述净化处理为取200μL到96孔板，加入600μL1%甲酸乙腈溶液，混匀，控制真空泵压力，使样品在2~4min流出，将N-甲基氨甲酰加合物充分降解为3-甲基-异丙基乙内酸脲。进一步的，所述步骤S2中所述色谱条件为柱温：25-45℃；流动相A：0.1%甲酸；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序为：0min~3min，A由90%~10%，3min~3.2min，A由10%~10%，3.2min~3.5min，A由10%~90%，3.5min~4.0min，A由90%~90%；流速：0.25mL/min；进样量：5μL。进一步的，所述步骤S2中所述质谱条件为毛细管电压：3.5kv；源温：150℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流速：800L/h。进一步的，所述步骤S3中所述3-甲基-异丙基乙内酸脲标准系列工作液的浓度为0.01nmol/mL、0.05nmol/mL、0.1nmol/mL、0.5nmol/mL、1.0nmol/mL、2.0nmol/mL，所述内标物3-甲基-异丁基海因浓度为0.5nmol/mL。本专利技术所述的一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法，采用固相萃取、超高效液相色谱-串联质谱技术分析，采用内标法，在电喷雾离子源电离和多反应监测模式条件下进行定量测定。本专利技术的有益效果：采用固相萃取将3-甲基-异丙基乙内酸脲与基质干扰物有效分离，同时内标3-甲基-异丁基海因与基质干扰物也可以有效分离，减少污染、提高灵敏度，定量更加准确，使用96孔板净化，快速检测。具体实施方式S3.标准曲线的建立实施例1：S1.样品的处理S11.用肝素抗凝的采血管采集某皮革厂二甲基甲酰胺职业暴露岗位18名工人血液5ml，离心15min，弃去血浆；用生理盐水洗红细胞两次，然后用1mL蒸馏水在超声状态下裂解红细胞；缓慢加入15mL预冷丙酮溶液（含有2%的浓盐酸）；沉降的蛋白离心5min，弃去上清液体，再用15mL所述丙酮溶液清洗3次，再用乙酸乙酯15mL清洗，氮气干燥；S12.准确称取0.1g的血红蛋白置于15mL离心管中，加入40nmol/mL的3-甲基-异丁基海因内标溶液250μL，再加入盐酸-醋酸(2:1，V/V)溶液4.75mL，振荡混匀3min；将离心管置于100℃水浴中加热降解1h，取出冷却；将降解后的溶液混匀，取200μL到96孔板，加入600μL1%甲酸乙腈溶液，控制真空泵压力，使样品在2~4min流出，混匀后得到待测样液，将待测样液转移到样品瓶中待测；S13.向另一15mL离心管加入40nmol/mL的3-甲基-异丁基海因内标溶液250μL，再加入盐酸-醋酸(2:1，V/V)溶液4.75mL，振荡混匀3min；将离心管置于100℃水浴中加热降解1h，取出冷却；将降解后的溶液混匀，取200μL到96孔板，加入600μL1%甲酸乙腈溶液，混匀后为得到空白样液，将空白样液转移到样品瓶中待测；S2液相色谱-串联质谱的建立色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱（5μm，100Å，2.1mmi.d.×150mm）；柱温：35℃；流动相A：0.1%甲酸；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序为：0min~3min，A由90%~10%，3min~3.2min，A由10%~10%，3.2min~3.5min，A由10%~90%，3.5min~4.0min，A由90%~90%；流速：0.25mL/min；进样量：5μL；质谱条件为：电离方式：电喷雾离子源（ESI+）；毛细管电压：3.5kv；源温：1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血中N‑甲基氨甲酰加合物的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.样品的处理S11.用肝素抗凝的采血管收集血样1‑10 mL，离心弃去血浆，裂解红细胞，再加入丙酮溶液（含有2%的浓盐酸），沉降离心弃上清液，清洗并干燥，得到血红蛋白；S12.准确称取0.01‑0.2g的血红蛋白置于离心管中，加入3‑甲基‑异丁基海因内标溶液，再加入盐酸‑醋酸(2:1，V/V)溶液后进行降解，将降解后的溶液进行净化处理得到待测样液，再将待测样液转移到样品瓶中待测；S13.向另一离心管加入3‑甲基‑异丁基海因内标溶液，再加入盐酸‑醋酸(2:1，V/V)溶液后进行降解，将降解后的溶液进行净化处理得到空白样液，再将空白样液转移到样品瓶中待测 ；S2液相色谱‑串联质谱的建立色谱条件：色谱柱：C18色谱柱；质谱条件：电离方式：电喷雾离子源（ESI+）；多反应监测模式：3‑甲基‑异丙基乙内酸脲监测72.0/157.1(定量)，129.1/157.1；3‑甲基‑异丁基海因监测86.0/171.1；S3.标准曲线的建立将3‑甲基‑异丙基乙内酸脲标准系列工作液和内标物3‑甲基‑异丁基海因进行测定，以3‑甲基‑异丙基乙内酸脲与内标3‑甲基‑异丁基海因的峰面积比值为纵坐标，以3‑甲基‑异丙基乙内酸脲标准系列工作液浓度为横坐标绘制标准曲线；S4.样品测定将所述待测样液和所述空白样液依次测定进样，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到测定液中3‑甲基‑异丙基乙内酸脲的浓度，并得到样品中N‑甲基氨甲酰加合物的浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.样品的处理S11.用肝素抗凝的采血管收集血样1-10mL，离心弃去血浆，裂解红细胞，再加入丙酮溶液（含有2%的浓盐酸），沉降离心弃上清液，清洗并干燥，得到血红蛋白；S12.准确称取0.01-0.2g的血红蛋白置于离心管中，加入3-甲基-异丁基海因内标溶液，再加入盐酸-醋酸(2:1，V/V)溶液后进行降解，将降解后的溶液进行净化处理得到待测样液，再将待测样液转移到样品瓶中待测；S13.向另一离心管加入3-甲基-异丁基海因内标溶液，再加入盐酸-醋酸(2:1，V/V)溶液后进行降解，将降解后的溶液进行净化处理得到空白样液，再将空白样液转移到样品瓶中待测；S2液相色谱-串联质谱的建立色谱条件：色谱柱：C18色谱柱；质谱条件：电离方式：电喷雾离子源（ESI+）；多反应监测模式：3-甲基-异丙基乙内酸脲监测72.0/157.1(定量)，129.1/157.1；3-甲基-异丁基海因监测86.0/171.1；S3.标准曲线的建立将3-甲基-异丙基乙内酸脲标准系列工作液和内标物3-甲基-异丁基海因进行测定，以3-甲基-异丙基乙内酸脲与内标3-甲基-异丁基海因的峰面积比值为纵坐标，以3-甲基-异丙基乙内酸脲标准系列工作液浓度为横坐标绘制标准曲线；S4.样品测定将所述待测样液和所述空白样液依次测定进样，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到测定液中3-甲基-异丙基乙内酸脲的浓度，并得到样品中N-甲基氨甲酰加合物的浓度。2.根据权利要求1所述的一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法，其特征在于，所述步骤S11中所述裂解红细胞为先用生理盐水清洗红细胞，再用蒸馏水在超声状态下裂解。3.根据权利要求1所述的一种血中N-甲基氨甲酰加合物的快速检测方法，其特征在于，所述步骤S...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春民，刘强，张秋萍，吴春霞，程娟，李建，
申请(专利权)人：苏州市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32