一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法及其应用，包括步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、超高相液相色谱测定、指纹图谱的建立、相似度评价和聚类分析。本发明专利技术建立了23 min内快速鉴别桑白皮药材的UPLC指纹图谱方法，并对数据进行相似度评价和聚类分析，该方法简单、高效，重复性好，为全面、有效控制和科学评价桑白皮药材的质量提供了依据。

【技术实现步骤摘要】
一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法及其应用
本专利技术属于药物分析及药物质量控制
，具体涉及一种桑白皮药材指纹图谱的构建方法及其应用。
技术介绍
桑白皮又名桑根皮、白桑皮，为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮。始载于《神农本草经》，其性味甘寒，归肺经，具有泻肺平喘，利水消肿。用于肺热喘咳，水肿胀满尿少，面目肌肤浮肿等症。现代研究表明桑白皮的化学成分主要桑白皮中主要含有黄酮类、酚酸类、生物碱类等成分；黄酮类化合物主要包括：桑素、桑色烯、桑白皮素C、D；酚酸类化合物主要为二苯乙烯类、2-苯基苯并呋喃类和芪类低聚物三类，主要有白藜芦醇、氧化白藜芦醇、桑皮苷A。此外，尚含少量三萜、香豆素及多羟基生物碱类化合物。具有镇咳、祛痰及平喘、抗糖尿病、抗病毒、抗炎、降血糖统、利尿等药理作用。目前，关于桑白皮指纹图谱或特征图谱方面的文献报道较少，2015年版《中国药典》仅收载性状、显微鉴别及薄层色谱鉴别，至今尚无明确化学成分指标评价桑白皮药材的品质，简单测定一个或几个有效(指标)成分的量已不能全面地反映药材的质量。随着现代分析技术的发展，指纹图谱作为一种体现中药化学成分整体特征的质量评价方法正在广泛应用，因此，有必要建立了一种快速鉴别桑白皮药材的UPLC指纹图谱方法，为有效控制和科学评价桑白皮药材的质量提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法，该方法为桑白皮药材的质量评价和控制提供了较为全面、系统、有效的快速评价方法。本专利技术是通过以下技术方案实现：一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：(a)对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A对照品2.459mg，置10ml量瓶中，加70％乙醇制成每1ml含桑皮苷A245.9μg的对照品溶液；(b)供试品溶液的制备：取桑白皮药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80％乙醇20-30ml，称定重量，水浴加热回流15-30分钟，放冷，用50-80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(c)超高相液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.5μl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱：0～2min，5％A；2～7min，5％→10％A；7～10min，10％→25％A；10～13min，25％→50％A；13～19min，50％→80％A；19～23min，80％A；检测波长：320nm；流速：0.38ml/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl；(d)指纹图谱的建立：将多批桑白皮药材的色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行共有峰标识，建立桑白皮药材的对照指纹图谱，确定具有14个共有峰，以峰1桑皮苷A的色谱峰为参照峰S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1：1.00、峰2：1.07、峰3：1.21、峰4：1.27、峰5：1.30、峰6：1.37、峰7：1.44、峰8：1.49、峰9：1.63、峰10：1.95、峰11：1.99、峰12：2.14、峰13：2.30、峰14：2.37，相对保留时间在规定值的±10％之内；(e)相似度评价：比较不同产地各批次桑白皮药材的色谱图与对照指纹图谱的相似度；(f)聚类分析：运用SPSS19.0软件对不同产地的桑白皮药材进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，得到不同产地的桑白皮药材的聚类结果。优选的，步骤(b)供试品溶液的制备：取桑白皮药材粉末，过三号筛，0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22um滤膜滤过，取续滤液，即得。本专利技术还提供了上述桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法在桑白皮药材质量评价和检测中的应用。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：①本专利技术采用UPLC方法建立了23min内快速鉴别桑白皮药材的指纹图谱，与现有方法相比，缩短了检测时间，提高分析效率，并对数据进行了相似度评价和聚类分析，该方法简单、高效，重复性好，为全面、有效控制和科学评价桑白皮药材的质量提供了依据。②本专利技术采用水浴加热回流30分钟作为样品前处理方法，与现有方法相比，在缩短了前处理时间的前提下达到了相同的效果，简便了前处理操作，提高了前处理方法的可重现性，同时节省了成本。③本专利技术通过与标准品对照，指认了特征峰1为桑皮苷A，并选择其作为参照峰，提高了方法的专属性，同时使其余特征峰的定位更准确，使方法更精确。附图说明图1为18批桑白皮药材UPLC指纹图谱叠加图；图2为18批桑白皮药材UPLC指纹图谱共有模式图；图3为18批桑白皮药材的聚类分析结果图；图4-6分别为254nm、280nm和320nm波长下的色谱图。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术，以下实施例为本专利技术具体的实施方式，但本专利技术的实施方式并不受下述实施例的限制。1、仪器与试药1.1仪器仪器：Waters高效液相色谱仪(H-Class，沃特世公司)；ME204E型万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；XP26型百万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ500D型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HWS28型恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；Milli-QDirect超纯水系统(默克股份有限公司)。1.2对照品和试剂桑皮苷A对照品(批号：17071002，成都普菲德生物科技有限公司，纯度>98％)；乙腈、磷酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。1.3药材不同批次桑白皮药材的产地和批号等信息详见表1。所有样品经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，样品存放于广东一方制药有限公司。本专利技术的样品分别采自云南、四川、广西三个产地，涵盖了桑白皮的道地产区和大宗产区，经检测均符合2015《中国药典》桑白皮项下有关要求，在产地和质量上具有代表性。表1桑白皮药材样品信息2、方法与结果2.1对照品溶液的制备精密称取桑皮苷A对照品2.459mg，置10ml量瓶中，加70％乙醇制成每1ml含桑皮苷A245.9μg的对照品溶液。2.2供试品溶液的制备取桑白皮药材粉末，过三号筛，0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22um滤膜滤过，取续滤液，即得。2.3超高相液相色谱测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.5μl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：色谱柱：AgilentSBC18柱(2.1×100mm，1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱：0～2min，5％A；2～7min，5％→10％A；7～10min，10％→25％A；10～13min，25％→50％A；13～19min，50％→80％A；19～23min，80％A；检测波长：320nm；流速：0.38ml/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl；3、供试品溶液制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（a）对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A对照品2.459 mg，置10 ml量瓶中，加70%乙醇制成每1 ml含桑皮苷A 245.9μg的对照品溶液；（b）供试品溶液的制备：取桑白皮药材粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60‑80%乙醇20‑30ml，称定重量，水浴加热回流15‑30 分钟，放冷，用50‑80%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；（c）超高相液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.5µl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B进行梯度洗脱：0~2min，5% A；2~7min，5%→10% A；7~10min，10%→25% A；10~13min，25%→50% A；13~19min，50%→80% A；19~23min，80% A；检测波长：320 nm；流速：0.38 ml/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl；（d）指纹图谱的建立：将多批桑白皮药材的色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行共有峰标识，建立桑白皮药材的对照指纹图谱，确定具有14个共有峰，以峰1 桑皮苷A 的色谱峰为参照峰S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1：1.00、峰2：1.07、峰3：1.21、峰4：1.27、峰5：1.30、峰6：1.37、峰7：1.44、峰8：1.49、峰9：1.63、峰10：1.95、峰11：1.99、峰12：2.14、峰13：2.30、峰14：2.37，相对保留时间在规定值的±10%之内； （e）相似度评价：比较不同产地各批次桑白皮药材的色谱图与对照指纹图谱的相似度； （f）聚类分析：运用SPSS19.0软件对不同产地的桑白皮药材进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，得到不同产地的桑白皮药材的聚类结果。...

【技术特征摘要】
1.一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（a）对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A对照品2.459mg，置10ml量瓶中，加70%乙醇制成每1ml含桑皮苷A245.9μg的对照品溶液；（b）供试品溶液的制备：取桑白皮药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80%乙醇20-30ml，称定重量，水浴加热回流15-30分钟，放冷，用50-80%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；（c）超高相液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.5µl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B进行梯度洗脱：0~2min，5%A；2~7min，5%→10%A；7~10min，10%→25%A；10~13min，25%→50%A；13~19min，50%→80%A；19~23min，80%A；检测波长：320nm；流速：0.38ml/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl；（d）指纹图谱的建立：将多批桑白皮药材的色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行共有峰标识，建立桑白皮...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹斯琼，李振雨，李国卫，王利伟，索彩仙，李乐，何民友，潘礼业，陈向东，
申请(专利权)人：广东一方制药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44