筛选分析、鉴别药剂的方法及药物组合物技术

本发明专利技术属于糖尿病预防和治疗领域，涉及筛选分析、鉴别药剂的方法及药物组合物，具体描述了用于鉴别诱导哺乳动物消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞表达胰岛素的药剂的基于细胞的高通量筛选分析方法、用于鉴别诱导不产生胰岛素的肠内分泌细胞分化为产生胰岛素的细胞的药剂的方法、鉴别有效治疗或预防糖尿病的药剂的方法和用于治疗低胰岛素的药物组合物。所述鉴别药剂高通量筛选分析方法、鉴别药剂的方法和所述药物组合物可用于治疗、预防和/或降低发展成与胰腺功能受损相关的糖尿病或其它疾病的风险。

【技术实现步骤摘要】
筛选分析、鉴别药剂的方法及药物组合物相关申请本申请是申请号为201180034542.5、申请日为2011年05月12日、享有申请日为2010年05月12日的申请号为US61/334,171的美国在先申请的优先权的，专利技术名称为“制备产生和分泌胰岛素的肠内分泌细胞的方法”的中国专利技术专利申请的分案申请。政府利益的声明本专利技术是基于美国国立卫生研究院授予的资助金DK057539和DK58282在政府的支持下做出的。政府对本专利技术有一定的权利。专利技术背景1.
治疗和预防1型和2型糖尿病的方法。2.
技术介绍
糖尿病是一类以慢性高血糖以及长期并发症为特征的病症。这类病症包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其它类型的糖尿病。免疫介导型(1型)糖尿病(或胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)是一种儿童和成人的疾病，目前还没有合适的治疗或预防方法。1型糖尿病占所有人糖尿病的约10％。1型糖尿病与非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的区别在于仅1型糖尿病涉及胰岛郎格罕细胞(pancreaticisletsofLangerhans)中产生胰岛素的β细胞的特异性损坏；胰腺中的α细胞(产生胰高血糖素)或δ细胞(产生生长激素抑制素)是多余的。胰腺β细胞的逐渐减少导致产生的胰岛素不足，因此引发伴随并发症的糖代谢异常。1型糖尿病主要发生在有遗传性糖尿病倾向的人中。虽然1型糖尿病的病因主要是来自基因组分，但是环境或非生殖基因因素也发挥着重要作用。在美国，患有1型糖尿病的人为1/300。1型糖尿病的患者数每年以约3％-5％的速率增长。从1992年开始，胰岛素已经成为治疗各型糖尿病和其它与胰岛素缺乏或产量减少有关的疾病的唯一可用的治疗方法，然而，胰岛素并不能预防所述疾病的长期并发症，所述疾病的并发症包括对血管、神经、眼睛和肾脏的损伤，这可能会影响视力、肾功能、心脏功能和血压，而且还可能引起循环系统的并发症。这是因为胰岛素治疗不能完全代替丧失的胰岛素功能。尽管经过数十年的研究，且在1974年出现了胰腺细胞移植以及埃德蒙顿方案(EdmontonProtocol)用于胰腺细胞移植成功的新主张，但是替换产生胰岛素的细胞的成功还是不乐观。与胰腺或胰腺移植有关的阻碍包括难以获得足量的组织，并且还没有克服被移植的胰腺存活率低和在受体体内成功发挥功能的问题。在移植四年后，还有不到10％的已经接受胰腺细胞移植的患者仍然表现为胰岛素依赖型。而且，尽管有了新的免疫抑制方法，但仍对18％的患者存在严重的副作用。因此，需要其它的治疗方案来治疗、预防和/或降低发展成与胰腺功能受损相关的糖尿病或其它疾病的风险。在描述本专利技术的实施方式之前，应该理解的是，本专利技术并不限于描述的具体过程、组分或方法，因为这些可以变化。还应该理解的是，说明书中使用的术语仅是为了描述特定的实施例(version)或实施方式，而不是为了限制本专利技术的范围，本专利技术的范围由随附的权利要求限定。除非明确指明，否则，本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本专利技术的实施方式的实践或试验中可以使用与本文中描述的这些相似或等价的任一方法和原料，但是现在描述的是优选的方法、设备和原料。本文提及的所有出版物都以引用的方式将其全部内容纳入本文。不能借助在先专利技术而将本专利技术理解为承认本专利技术没有资格早于这些公开文本。附图说明附图中的各图仅以示例性方式而不是以限制性的方式来说明本专利技术，其中：图1.NKO小鼠中的产生胰岛素的肠细胞。(A)对照小鼠和交叉有Neurog3-Gfp报告小鼠的NKO小鼠的肠中Neurog3-Gfp(红)和Foxo1(绿)的共定位分析。(B)NKO小鼠中Neurog-Gfp和Foxo1的共定位分析的缺乏。(C)胰腺(轮廓)和肠中的胰岛素免疫组织化学(红)染色。最初放大倍数：200×。样本是从1天大的小鼠中获得的。(D)在对照小鼠和交叉有Ins2-Gfp敲入小鼠的NKO小鼠的胰腺(顶部)和绒毛(底部)中的直接荧光。(E)用pNKO：Ins2-Gfp小鼠中的胰岛素(红)和Gfp(绿)进行两倍免疫荧光。(F)在NKO:Rosa26eGf小鼠和对照杂合同窝出生仔畜中进行谱系跟踪实验。用Gfp(绿)和胰岛素(红)进行免疫组织化学染色分析。Gfp+/Ins+细胞(用箭头表示)是重组酶介导的重组发生的细胞的后代。图1的1G(临时图(prov)中的旧图1L)总结了Ins2+细胞的定位。成年小鼠肠的示意图表明了神经元素3-Gfp+(红三角形)和Ins2+细胞的定位，这从NKO:Ins2-Gfp和NKO:神经元素3-GFP小鼠中可以得出。将这个插入到图1F之后的PPT中。图2.消化道Ins+细胞与胰腺β-细胞具有共同的基本特征。用(A)葡糖激酶(Gck)、(B)激素原转化酶2(Pc2)、(C)磺酰脲受体1(Sur1)、(D)葡萄糖转运子2(Glut2)和(E)突触素进行免疫荧光。C中的插图显示了双阳性细胞的实例。最初放大倍数：100×(A、C、D、E)和200×(B)。图3.胰岛素的分泌和生物活性。(A，B)补充有指示浓度的葡糖糖和0.5mM二氮嗪(Dzx)或10nM格列本脲(Glib)的HEPES-KrebsRinger缓冲液中培养的NKO(蓝柱)和对照(黑柱)肠中葡萄糖依赖型胰岛素和C肽的分泌。使用成年肠进行实验(n＝4)。将WT胰腺作为对照。(C)NKO(蓝柱)或对照小鼠(黑柱)中酸-乙醇提取物对5天大的小鼠腹腔注射后的血糖水平的影响。用抗胰岛素中和抗体(InsAb)或同种型匹配对照IgG(IgG)预培养所述样品。在注射前，先将重组人胰岛素经过酸-乙醇沉淀(酸/EtOH)(a和b中n＝8，c中n＝12)。图4.STZ-介导的消融后消化道Ins+细胞的再生。(A)NKO小鼠(正方形)和对照小鼠(菱形)中喂食的葡萄糖水平。箭头表示STZ给药(STZ)和处死(SAC)的时间。从第3天至第28天，给药WT对照小鼠胰岛素(2-4U/qd)(n＝16)。(B)STZ后NKO小鼠和WT对照小鼠的存活图(n＝16并且，各自地)。(C)给药STZ前后NKO小鼠中的口服葡萄糖耐受性试验和给药STZ后WT对照小鼠中的口服葡萄糖耐受性试验。(D)用抗胰岛素(D0和D3)以及抗胰岛素和抗Pc2抗体(D28)进行注射STZ前(D0)后(D3和D28)NKO肠中的消化道Ins+细胞的免疫组织化学染色分析。右图中显示的是注射STZ前(D0)后(D28)的对照胰腺部分的胰岛素免疫染色。(E)注射STZ后消化道Ins+细胞的谱系追踪。用如该方法所示STZ处理NKO:Ins2-Gfp双突变小鼠，并用抗Gfp(绿)或Pc2(红)抗体给肠部分染色。在D和E中，我们从每个区域测量到了三种水平的十二指肠、空肠、回肠和结肠(n＝4)。最初的放大倍数：200×。图5.肠Neurog3的定位。用Neurog3-Gfp转基因小鼠的新生消化道中的抗Neurog3(红)和抗Gfp(绿)进行免疫组织化学染色分析。两种检测方法的完全重叠表明Gfp是消化道中Neurog3定位可靠的标记。最初的放大倍数：100×。图6.肠内分泌祖细胞中Foxo1消融扩大了Neurog3+细胞池。(A)在WT和NKO小鼠中用抗Neurog3抗体(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别诱导哺乳动物消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞表达胰岛素的药剂的基于细胞的高通量筛选分析方法，该方法包括下述步骤：a.提供消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞的对照细胞群和测试细胞群，b.将测试细胞群和测试药剂接触，c.测定对照细胞群和测试细胞群的胰岛素表达水平，和d.如果测试细胞群中的胰岛素水平明显高于对照细胞群中的胰岛素水平，筛选出该测试药剂。

【技术特征摘要】
2010.05.12 US 61/334,1711.一种用于鉴别诱导哺乳动物消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞表达胰岛素的药剂的基于细胞的高通量筛选分析方法，该方法包括下述步骤：a.提供消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞的对照细胞群和测试细胞群，b.将测试细胞群和测试药剂接触，c.测定对照细胞群和测试细胞群的胰岛素表达水平，和d.如果测试细胞群中的胰岛素水平明显高于对照细胞群中的胰岛素水平，筛选出该测试药剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞中，编码胰岛素的基因与被可视化的蛋白或肽可操作连接。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述蛋白或肽是荧光蛋白。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述蛋白或肽是选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、尿素酶和β半乳糖苷酶组成的组中的成员。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述药剂对治疗糖尿病具有疗效。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，筛选了药剂文库。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述药剂降低Foxo1、Foxo3、Foxo4或它们的组合的表达。8.一种用于鉴别诱导不产生胰岛素的肠内分泌细胞分化为产生胰岛素的细胞的药剂的方法，该方法包括：(a)准备胰腺功能均受损的非人类测试动物和非人类对照动物，(b)用药剂对测试动物进行给药，(c)测试两个动物中产生胰岛素的细胞的指标的水平，所述指标选自由血清胰岛素、胰岛素敏感性...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·塔尔查，D·阿奇利，
申请(专利权)人：哥伦比亚大学纽约管理委员会，
类型：发明
国别省市：美国,US