一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法技术

本发明专利技术属于药物筛选领域，公开了一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法，所述抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法为：采用紫海胆的放线菌利用分菌技术进行分离，利用培养技术和萃取技术得发酵液浸膏，通过活性筛选和结构新颖性筛选有价值的放线菌，对放线菌进行小规模发酵、提取浸膏，对提取的化合物进行分离，并进行结构鉴定，活性确认。本发明专利技术首次对海南南海紫海胆肠道放线菌的活性次级代谢产物进行检测与筛选，首次利用海洋生物肠道放线菌发酵产物筛选抗石斑鱼病原弧菌活性的活性分子，从中筛选出抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法
本专利技术属于药物筛选
，尤其涉及一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：弧菌广泛分布于海洋环境中，是海洋环境中最常见的一类条件致病菌，随着养殖水域生态环境的恶化、养殖品种密度的加大以及养殖过程中自身污染的加重，已成为海水养殖动物的主要病原菌之一。已报道引起海水养殖动物发生弧菌病的弧菌有20多种,主要有哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、灿烂弧菌(V.splendidus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、最小弧菌(V.minius)、鳗弧菌(V.anguillarum)和费氏弧菌(V.fischeri)等，危害对象包括石斑鱼、香鱼、鳗鲡、鲨鱼、鲑鳟鱼、鳕鱼、真鲷、梭鱼、牙鲆、大菱鲆、平鲷、尖吻鲈等鱼类，对虾类、蟹类等甲壳类，鲍、文蛤、海湾扇贝、牡蛎等贝类，弧菌病害已成海水养殖病害重要的防治对象之一。石斑鱼是海南、广东、福建等省份广泛养殖的海水名贵食用鱼类，是南方沿海最重要的养殖鱼类之一，目前有室内工厂化养殖，室外水泥池养殖、土池养殖、海上网箱养殖等多种养殖方式，养殖密度高，易感染弧菌病，是引起海水养殖石斑鱼细菌性疾病的最主要病原菌之一，给养殖者造成巨大的经济损失。而引起南方网箱养殖石斑鱼溃烂病的病原主要是溶藻弧菌和哈维氏弧菌，其亦能感染多种海水养殖鱼类并造成严重死亡，是一类严重危害海水养殖鱼类的重要病原菌。已有研究表明许多病原弧菌特别是溶藻弧菌对青霉素类、氟哌酸和氯霉素等药物具有抗性。因此，加强防治病原弧菌的药物研发对有效防治石斑鱼弧菌病及提高其养殖效益具有重要意义。抗生素已被广泛应用于控制水产养殖病害，但由于抗生素和各种化学药剂的滥用，导致许多耐药性病菌的产生。随着海水养殖病原菌抗生素耐药性的逐渐增加，寻找高效、无并发症的药物也越来越重要。而海洋微生物次级代谢产物由于抗菌效果显著，对其在抗菌治疗方面意义非常重大。海洋微生物具有抗菌活性的次级代谢产物结构新颖，类型多样，尤其是许多具有较强生物学活性的小分子结构，如大环内酯类、生物碱类、肽类、萜类、醌类等，通过结构修饰等可能成为药物先导化合物的重要来源，而且其来源的特殊性，有利于解决可能的药源问题，是目前海洋天然产物研究的重点和热点。微生物产生的活性物质中超过50％来自于放线菌，由于放线菌在产生新型活性代谢产物方面的能力非常突出，在过去的50年里科学家们一直致力于从陆栖微生物源中分离新型放线菌。然而，近年来从陆栖放线菌中分离得到的新型化合物的数量在持续减少，因此人们需要从未开发的放线菌栖息地中寻找新型的放线菌，作为开发新型活性次级代谢产物的来源。由于海洋环境的特殊性，海洋放线菌在生理生化特性和遗传背景特性上与陆生放线菌存在差异，使得海洋放线菌能够产生结构新颖的活性代谢产物。海洋放线菌分布于不同的海洋环境和栖息地，已有大量研究证明可以在海洋的任何地方找到新颖的放线菌，包括从深海海底到珊瑚礁、从海底沉积物到海洋无脊椎动物和植物、从海洋的表面到海底深渊都可发现海洋放线菌的踪迹。近年来，专性海洋放线菌Salinispora属菌株被报道能产生多种结构多样的次级代谢物，该属放线菌被证明是新化学结构物质丰富的来源，包括潜在的蛋白酶抑制剂salinosporamideA，新萜类化合物，氨基酸衍生物，以及多烯大环内酯类。海洋放线菌在水产养殖中具有重要的应用价值，已有研究海洋放线菌应用于水产养殖致病菌引起病害的预防。中山大学游建岚等报道了利用海洋放线菌治疗和预防致病性弧菌引起的虾病害，能够抑制弧菌菌膜的形成，其在养殖池塘水系中产抗菌类物质。现有技术一报道了海洋链霉菌作为益生菌应用于促进斑节对虾的生长。现有技术二从海洋放线菌中提取抗菌物质，并将其与食物一同喂养凡纳滨对虾，对具白点综合症病毒的对虾产生抗病毒效应。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)目前弧菌病害已成海水养殖病害重要的防治对象之一，对石斑鱼的养殖密度高，易感染弧菌病，是引起海水养殖石斑鱼细菌性疾病的最主要病原菌之一，给养殖者造成巨大的经济损失。(2)目前的多病原弧菌特别是溶藻弧菌对青霉素类、氟哌酸和氯霉素等药物具有抗性，难以进行预防。解决上述技术问题的难度和意义：目前已经将海洋微生物应用于水产养殖致病菌引起病害的预防，可能是其产生活性分子的作用，这为海水水产养殖病害控制提供了很好的研究方向，同时，微生物具有生长繁殖快、易于培养的优点，可通过育种、培养条件控制等技术来提高其有效成分的含量，并可利用发酵工程来实现工业化大规模生产，从而从根本上解决原材料短缺的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法。本专利技术是这样实现的，一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法为：步骤一：紫海胆先用无菌陈海水浸洗3次，每次10分钟，然后置于75％酒精中消毒10分钟，再用无菌生理盐水洗3遍，无菌滤纸吸干表面水分后再用无菌剪刀和解剖刀小心解剖，取出肠道于无菌生理盐水中并捣碎，用无菌生理盐水梯度稀释，吸取200μL，涂布在含有50μg/mL重铬酸钾和20μg/mL卡那霉素的高氏培养基平板上，然后置于28℃培养箱中培养15天，期间定期检查，当有疑似放线菌菌落长出时，小心挑取单菌落划线接种到新鲜ISP2培养基平板上培养，经2～3次划线纯化挑取单菌落获得纯培养菌株。步骤二：将分离纯化得到的菌株接种于200mL的液体高氏培养基和ME培养基(1L含有以下质量的组分：麦芽提取物10～15g、葡萄糖10～15g、蛋白胨1～2g，pH值为7.0～7.2)中，在26～28℃下以160～210r·min-1振荡培养10～14d，得到发酵液；过滤发酵液得到菌液和菌体，菌液用等体积的乙酸乙酯提取2～3次，菌体用氯仿甲醇(体积比为1:1)浸提2～3次，40～60℃下减压浓缩得到的提取物供抗病原菌活性筛选；步骤三：用二甲基亚砜将发酵液的乙酸乙酯提取物样品配成浓度为5mg/mL的溶液，然后将该50μL样品溶液加于直径6mm的灭菌滤纸圆片上，再将其贴于已涂供试菌悬液的培养基平板上，放置20min后再放入培养箱中，28℃暗培养7天，测其抑菌圈大小。结果筛选出2株菌株发酵产物对石斑鱼病原溶藻弧菌菌株具有生长抑制活性，抑菌圈直径为8～17mm；步骤四：对筛选得到的上述活性菌株进行发酵条件的优化，通过18℃低温刺激、改变发酵培养基不同的碳源(葡萄糖或蔗糖)、氮源(蛋白胨或酵母膏)或者添加微量稀土元素等，进行200mL小规模发酵，其发酵液经乙酸乙酯提取得粗提物，并进行抗病原弧菌活性筛选；同时利用HPLC-MS-UV等方法分析优化前和优化后的发酵产物成分变化，综合考虑其发酵产物的生物活性和化学多样性，选择能够诱导菌株发酵产物活性更强、产物更丰富的发酵条件作为活性菌株大规模发酵的条件。步骤五：利用优化后得到的改良ME培养基(1L含有以下质量的组分，麦芽提取物10g、蔗糖20g、蛋白胨2g，pH值为7.2)对筛选得到的活性放线菌菌株StreptomycesspectabilisHDa1进行大规模发酵，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法，其特征在于，所述抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法为：步骤一：将采用无菌陈海水冲，75％酒精消毒及用无菌水洗3遍后的紫海胆，取其肠道组织置于无菌水中，稀释，吸取200μL，涂在含有50μg/mL重铬酸钾和20μg/mL卡那霉素的高氏培养基平板上，在28℃下培养15天，挑取单菌落划线接种至ISP2培养基平板上，经3次单菌落划线纯化即得到放线菌菌株；步骤二：利用液体高氏培养基和麦芽提取物培养基小规模发酵所纯化的放线菌，过滤发酵液得到菌液和菌体，将菌液浓缩后用乙酸乙酯提取，菌体用氯仿甲醇，体积比为1:1浸提，浓缩后得到的提取物供抗病原菌活性筛选；步骤三：采用平板滤纸片法筛选出2株菌株发酵液的乙酸乙酯粗提物对石斑鱼溶藻弧菌菌株具有生长抑制活性，抑菌圈直径为8–17mm；步骤四：利用上述培养基并通过优化培养条件和添加诱导物小规模发酵上述2株活性菌株，过滤除去菌体，用乙酸乙酯萃取发酵液，得粗提物，并进行活性筛选，并对诱导后的菌株产生的新次级代谢产物进行检测；步骤五：分别利用筛选培养基和添加诱导物的培养基对2株放线菌在优化好的培养条件下进行大规模发酵，发酵液与菌丝体分别以乙酸乙酯、等体积的氯仿甲醇萃取3遍，然后在抗菌活性筛选指导下，采用多种色谱分离技术将活性成分从发酵液和菌体粗提物中分离精制出来；步骤六：综合运用现代波谱技术确定单体化合物的化学结构及空间立体化学结构；步骤七：用平板滤纸片法对上述结构确定的活性化合物进行抗石斑鱼病原弧菌活性评价，排除假阳性可能和其他干扰，以得到真正的抗菌、抗病新活性物质；步骤八：对以上活性确定的化合物，采用化学或生物合成的方法进行结构修饰、制备系列衍生物，再进行活性评价，确定其构效关系，筛选出活性更强、毒性更低的防治石斑鱼弧菌病害药物的生物源天然药物先导化合物。...

【技术特征摘要】
1.一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法，其特征在于，所述抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法为：步骤一：将采用无菌陈海水冲，75％酒精消毒及用无菌水洗3遍后的紫海胆，取其肠道组织置于无菌水中，稀释，吸取200μL，涂在含有50μg/mL重铬酸钾和20μg/mL卡那霉素的高氏培养基平板上，在28℃下培养15天，挑取单菌落划线接种至ISP2培养基平板上，经3次单菌落划线纯化即得到放线菌菌株；步骤二：利用液体高氏培养基和麦芽提取物培养基小规模发酵所纯化的放线菌，过滤发酵液得到菌液和菌体，将菌液浓缩后用乙酸乙酯提取，菌体用氯仿甲醇，体积比为1:1浸提，浓缩后得到的提取物供抗病原菌活性筛选；步骤三：采用平板滤纸片法筛选出2株菌株发酵液的乙酸乙酯粗提物对石斑鱼溶藻弧菌菌株具有生长抑制活性，抑菌圈直径为8–17mm；步骤四：利用上述培养基并通过优化培养条件和添加诱导物小规模发酵上述2株活性菌株，过滤除去菌体，用乙酸乙酯萃取发酵液，得粗提物，并进行活性筛选，并对诱导后的菌株产生的新次级代谢产物进行检测；步骤五：分别利用筛选培养基和添加诱导物的培养基对2株放线菌在优化好的培养条件下进行大规模发酵，发酵液与菌丝体分别以乙酸乙酯、等体积的氯仿甲醇萃取3遍，然后在抗菌活性筛选指导下，采用多种色谱分离技术将活性成分从发酵液和菌体粗提物中分离精制出来；步骤六：综合运用现代波谱技术确定单体化合物的化学结构及空间立体化学结构；步骤七：用平板滤纸片法对上述结构确定的活性化合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蓉，谭围，陈傅晓，冯全英，樊佳伟，王荣霞，柯宏基，
申请(专利权)人：海南省海洋与渔业科学院海南省海洋开发规划设计研究院，
类型：发明
国别省市：海南,46