人参形成层干细胞分离培养方法技术

本发明专利技术涉及人参形成层干细胞的分离培养方法，所述方法包括用本发明专利技术的式I化合物处理含有人参形成层的组织的步骤。本发明专利技术还涉及根据本发明专利技术的方法获得的人参形成层干细胞及其在制备用于人参悬浮培养的产品中的用途。本发明专利技术中提供的人参形成层细胞分离及培养方法可以有效地分离人参的形成层细胞，形成层细胞具有无限分裂能力，生长快速，抗逆能力强，为超大体积的液体培养提供基础，可以显著减少生产成本。

【技术实现步骤摘要】
人参形成层干细胞分离培养方法
本专利技术涉及人参形成层干细胞的分离培养方法、由此获得的人参形成层干细胞及其在制备用于人参悬浮培养的产品中的用途。
技术介绍
人参是五加科人参属多年生双子叶植物，是我国传统的名贵中药材。目前人参已经越来越广泛地应用于药品、保健品以及化妆品领域。人参的来源包括野生来源、人工栽培和组织培养。由天然野生来源的人参资源有限，根本无法满足市场需求；人工栽培仍然是目前人参的主要来源，但人工栽培存在砍伐林木、占用耕地、生长周期长、易受病虫害影响、存在农药及重金属残留等诸多明显缺点。组织培养方式是利用愈伤组织或不定根进行培养获取，可以克服野生来源有限、人工栽培诸多缺陷等问题，不受外部环境约束且在最佳条件下能够获得植物主要成分，是提供人参资源的最有前景的优选方式。然而，愈伤组织和不定根存在分裂能力有限、易退化、抗逆能力弱等缺陷，并不适合进行大规模连续培养。人们发现，植物干细胞是一类具有无限的自我更新和分化成多种细胞和组织类型能力的细胞。研究表明，植物干细胞嵌入在茎顶端分生组织、根尖分生组织和维管形成层分生组织中，它们能自我更新，能够分裂和产生新的细胞，一部分子细胞进行分化，另一部分形成新的干细胞。植物干细胞的功能贯穿植物的整个生命过程，并为根、茎和叶等器官的形成和再生不断提供新的细胞来源。植物的维管系统形成层包含有多能的干细胞，为干细胞提供小生境，并维持干细胞的数量和功能。为解决脱分化细胞因遗传信息缺失导致长期培养不稳定及次生代谢产物产量低等问题，数十年来，科学家们致力于植物干细胞的分离及离体培养，并获得成功。因此，来自植物干细胞的组织培养成为提供珍贵药用植物来源的重要渠道。与脱分化细胞相比，植物干细胞保留了母本全套的遗传信息，有利于长期稳定培养；植物干细胞具有小而多的液泡，抗剪切力强，并且可保持同步生长和高生长率；植物干细胞长期稳定合成多种类型的活性次生代谢产物。对于分离形成层细胞并用于组织培养，现有技术已有报道。例如，CN104920227A公开了一种利用形成层在分离培养基上培养的干细胞组培育苗技术；CN103509749A公开了一种人参形成层干细胞分离及培养方法，包括将东北人参消毒处理、将半圆形切片在培养基上培养、分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养等步骤。然而，这些组织培养方法和育苗技术所获得的人参干细胞的分裂活性还不够高，其增殖能力还不能让人满意。为了获取更高效的人参干细胞，提高组织培养的效率，克服已有方法存在的缺陷，现有技术迫切需要新的更高效的人参干细胞的分离培养方法。
技术实现思路
本专利技术一个目的在于提供一种可提高端粒酶的活性的人参形成层干细胞分离培养方法。本专利技术人经过大量研究，通过筛选试验后意外地发现，用下述式I的皂苷化合物处理含有人参形成层的组织可以显著提高端粒酶的活性，其中R为-β-D-葡萄吡喃糖基(1-2)-β-D-葡萄吡喃糖(皂苷a)或-β-D-葡萄吡喃糖(皂苷b)。基于上述发现，在本专利技术的第一个方面，提供了一种分离和/或培养人参形成层干细胞的方法，包括用式I化合物处理含有人参形成层的组织的步骤:其中R为-β-D-葡萄吡喃糖基(1-2)-β-D-葡萄吡喃糖或-β-D-葡萄吡喃糖。优选地,在本专利技术的所述分离和/或培养人参形成层干细胞的方法中，其中所述含有人参形成层的组织是通过包括下述步骤的方法获得的：将含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织从木质部剥离。在本专利技术的一些优选的实施方案中，用式I化合物处理含有人参形成层的组织是通过将含有人参形成层的组织置于含有式I化合物的溶液中实现的。所述溶液优选为式I化合物的水溶液。在本专利技术的一些实施方案中，用于处理人参形成层组织的式I化合物可以为一种化合物，例如其中R为-β-D-葡萄吡喃糖基(1-2)-β-D-葡萄吡喃糖的式I化合物(皂苷a)，或者其中R为-β-D-葡萄吡喃糖的式I化合物(皂苷b)；也可以为皂苷a和b的混合物，即其中R为-β-D-葡萄吡喃糖基(1-2)-β-D-葡萄吡喃糖的式I化合物与其中R为-β-D-葡萄吡喃糖的式I化合物的任意比例的混合物。在一些特别优选的实施方案中，所述R为-β-D-葡萄吡喃糖基(1-2)-β-D-葡萄吡喃糖的式I化合物(皂苷a)与所述R为-β-D-葡萄吡喃糖的式I化合物(皂苷b)的摩尔比例为1:10～10:1，优选为1:5～5:1，更优选为1:3～3:1。特别优选地，皂苷a与皂苷b的摩尔比例为2:5。在本专利技术的方法中，所述式I化合物的溶液的浓度为1μM-100μM，优选为10μM-100μM。在一个特别优选的实施方案中，式I化合物为皂苷a与b的摩尔比例2:5的混合物，且各自在溶液中的浓度分别为20μM和50μM。在本专利技术的一些优选实施方案中，在用式I化合物处理后，将含有人参形成层的组织进行超声处理。所述超声处理的频率为5kHz至100kHz，优选20kHz至40kHz；处理时间为0.1min至10min。在本专利技术的一些优选实施方案中，在式I化合物处理和/或超声处理后，采用蔗糖溶液进行处理。在本专利技术的另一方面，提供了根据本专利技术的方法获得的人参形成层干细胞。在本专利技术的又一方面，提供了根据本专利技术的方法获得的人参形成层干细胞在制备用于人参悬浮培养的产品中的用途。例如，可将本专利技术方法获得的人参形成层干细胞进行悬浮培养，以获得人参植株。在本专利技术的一些优选的实施方案中，本专利技术的分离和/或培养人参形成层干细胞的方法，可以包括以下步骤：(1)消毒：将洗净的人参药材用消毒剂消毒；(2)防褐变处理：将消毒的人参材料用含有抗氧化剂的褐变抑制培养基处理；(3)分离：将防褐变处理的人参材料置于含抗氧化剂的切削液中，将含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织从木质部剥离；(4)皂苷处理：将剥离的组织用本专利技术的皂苷化合物a和/或b处理，并任选地进行超声处理和蔗糖处理；(5)培养：将皂苷处理后的组织进行组织培养，分离并获得形成层细胞。在上述分离和/或培养人参形成层干细胞的方法中，步骤(1)的消毒步骤优选包括先采用75％的乙醇进行表面消毒，然后再采用次氯酸钠进行消毒。采用次氯酸钠的浓度优选为2％,并且优选消毒两次，第一次消毒时间优选为8min，第二次消毒时间优选为4min。步骤(4)中进行超声处理的超声波频率优选为20kHz，超声波处理时间优选为5min；蔗糖处理的浓度优选为1M，蔗糖处理时间优选为4h；皂苷a处理时的浓度优选为20uM，皂苷b处理时的浓度优选为50uM，处理时间为5h。分离培养基优先含有3.0mg.L-1IBA与0.5mg.L-1KT的B5培养基。步骤(5)中的培养优选包括先用MS培养基或B5培养基的初步培养，然后再进行继代培养；所述继代培养基优选为含有3.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6.0mg.L-1NAA的MS培养基。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术提供的人参形成层干细胞分离培养方法可以有效地分离人参的形成层细胞，形成层细胞具有无限分裂能力，生长快速，抗逆能力强，提高了端粒酶活性。而且通过超声波和高渗透处理可以有效的使特异组织坏死，形成层细胞由于抗逆能力强而被有效诱导,且有效的缩短了高渗处理的时间，减少了染菌概率。同时控制培养基中激素浓度，使形成层细胞增殖的同时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离和/或培养人参形成层干细胞的方法,其特征在于，包括用式I化合物处理含有人参形成层的组织的步骤:

【技术特征摘要】
1.一种分离和/或培养人参形成层干细胞的方法,其特征在于，包括用式I化合物处理含有人参形成层的组织的步骤:其中：R为-β-D-葡萄吡喃糖基(1-2)-β-D-葡萄吡喃糖或-β-D-葡萄吡喃糖。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有人参形成层的组织是通过下式方法获得的：将含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织从木质部剥离。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用式I化合物处理含有人参形成层的组织是通过将含有人参形成层的组织置于含有式I化合物的溶液中实现的。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所用式I化合物的溶液的浓度是10μM-100μM。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述式I化合物为其中R为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴冬，代陈胜，成丽丽，陈怀德，刘民宪，侯丽丽，江灼和，刘雨佳，凌远建，
申请(专利权)人：深圳先声科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44