一种人参皂苷含量高的人参细胞培养方法技术

本发明专利技术涉及药用植物生物技术领域，具体公开了一种低成本、可大规模工业生产的人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，包括人参细胞系诱导：对老山参消毒切片后超声波处理，置于培养基中培养；人参细胞系筛选：选择多种培养基并使用激素进行细胞分离培养，以筛选生长形态好、长势快的细胞系并进行固体继代和液体悬浮培养；转化条件优化：对筛选的细胞系进行酸处理，并控制转化温度以及转化时间，检测干燥产物中的人参皂苷Rg3和Rh2，并根据总和量确定最优转化条件；大规模工业化生产：根据最优转化条件，对筛选的细胞系进行液体悬浮培养并对培养规模梯级放大，以获得产量高、转化后人参皂苷含量高的规模化工业生产的人参细胞产物。苷含量高的规模化工业生产的人参细胞产物。苷含量高的规模化工业生产的人参细胞产物。

【技术实现步骤摘要】
一种人参皂苷含量高的人参细胞培养方法


[0001]本专利技术涉及药用植物生物
，特别是涉及一种通过人参细胞系诱导、筛选以及转化，获得人参皂苷含量高的人参细胞培养方法。

技术介绍

[0002]人参是一种多年生五加科草本植物，喜阴凉，多生长在背阴山地缓坡的针阔混交林或杂木林中，由于人参根部肥大，多呈圆柱状或纺锤状结构，且常有分叉，全貌颇似人型，故而称为人参，传统医学认为人参具有大补元气，复脉固脱、补脾益肺、生津止渴以及安神益智的功效，因而被用作多种成方、验方的主药。
[0003]传统的人参来源主要通过种植获得，由于受到土地、气候以及季节等因素限制，且种植参的人参皂甙含量低，使得人参的品质和产量难以满足市场需求。目前已有通过对人参细胞进行研究来提升人参皂苷产量的技术方法，但此类方法存在人参细胞不稳定，无法稳定传代，使得人参细胞难以形成工业化、规模化的稳定生产。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要针对人参细胞不稳定，难以稳定量产的技术问题，提供一种通过人参细胞系诱导、筛选以及转化，获得人参皂苷含量高的人参细胞培养方法。
[0005]一种人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，该培养方法包括以下步骤：
[0006]S1人参细胞系诱导：对老山参消毒切片后进行超声波处理，并置于培养基中培养以诱导细胞生长；
[0007]S2人参细胞系筛选：选择多种培养基并使用不同浓度、不同种类的激素进行细胞分离培养，筛选一种或几种生长形态较好、长势较快的细胞系，分别进行固体继代和液体悬浮培养；<br/>[0008]S3转化条件优化：采用多种不同浓度的弱酸对筛选的细胞系进行酸处理，并控制转化温度以及转化时间，检测干燥产物中的人参皂苷Rg3和Rh2，根据人参皂苷Rg3和Rh2总和量最高确定最优转化条件；
[0009]S4大规模工业化生产：根据最优转化条件，对筛选的细胞系进行液体悬浮培养并对培养规模梯级放大，以获得产量高、转化后人参皂苷含量高的规模化工业生产的人参细胞产物。
[0010]在其中一个实施例中，步骤S1中，消毒方式为削除流水洗净后的老山参的表皮，酒精浸泡消毒30s
‑
1min后采用浓度为0.5
‑
10％的NaClO消毒两次。
[0011]在其中一个实施例中，NaClO消毒包括采用2％NaClO先消毒8min，经无菌水冲洗后，采用2％NaClO再消毒4min。
[0012]在其中一个实施例中，老山参在CS切削液中进行切片并在BIM溶液中进行超声波处理，CS切削液包括PVP0.5％w/v、抗坏血酸100mg/L以及柠檬酸150mg/L，BIM溶液包括WPM盐1/4含量、蔗糖1％w/v、PVP0.5％w/v、抗坏血酸100mg/L以及柠檬酸150mg/L。
[0013]在其中一个实施例中，步骤S1中，超声波处理的频率为5kHz至100kHz；处理时间为0.1min至10min。
[0014]在其中一个实施例中，步骤S2中的培养基包括MS培养基、B5培养基或White培养基，激素包括0.5mg/L
‑
6mg/L的2,4
‑
D、NAA、IBA或KT中的一种或多种。
[0015]在其中一个实施例中，步骤S3中采用浓度为0.1％
‑
30％的柠檬酸、冰醋酸以及抗坏血酸对筛选的细胞系进行酸处理，转化温度为60℃
‑
90℃，转化时间为12h
‑
20h。
[0016]在其中一个实施例中，产物干燥后，采用80％甲醇提取，并通过HPLC检测人参皂苷Rg3和Rh2的含量。
[0017]在其中一个实施例中，步骤S4中，当选用实验室摇床时，液体悬浮培养的培养规模梯级放大包括250ml，500ml，1L；当选用工业化发酵罐时，液体悬浮培养的培养规模梯级放大包括50L，100L，500L。
[0018]在其中一个实施例中，当选用工业化发酵罐时，发酵罐的通气量为2
‑
20L/min、罐压为0.03
‑
0.05MPa、接种量为20％
‑
50％、培养时间为20
‑
30d。
[0019]实施本专利技术的人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，可以促进人参细胞的快速生长和稳定传代，并提升人参细胞的产量；通过对切片后的老山参进行超声波处理，使得老山参切片中的特定组织失活，从而实现对人参细胞系的诱导生长，以提升人参细胞中人参皂苷Rg3和Rh2的含量，这样一来，避免了因种植产生的土地资源浪费，且成本较低，能够进行工业化生产，不受季节气候等条件限制，无农药残留及重金属污染，能够稳定连续生产，以满足市场需求。
附图说明
[0020]图1为本专利技术的一实施例中人参皂苷含量高的人参细胞培养方法的流程图。
具体实施方式
[0021]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。
[0022]请参阅图1，本专利技术提供了一种通过人参细胞系诱导、筛选以及转化，获得人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，该培养方法包括以下步骤：
[0023]步骤S1人参细胞系诱导：对老山参消毒切片后进行超声波处理，并置于培养基中培养以诱导细胞生长。
[0024]具体的，选择50年龄以上的老山参，在流水下将老山参表面的泥土冲洗干净，随后采用手术刀削掉洗净后的老山参的表皮以及根须，实现对老山参的预处理。将预处理后的老山参置于超净工作台中，采用酒精对老山参浸泡消毒30s
‑
1min，优选的，采用浓度为75％的酒精对老山参浸泡消毒1min。酒精消毒后，采用无菌水冲洗老山参的表皮，以去除老山参表皮上残留的酒精，随后采用浓度为0.5
‑
10％的NaClO对老山参消毒两次。进一步的，两次NaClO消毒包括采用2％NaClO先消毒8min，经无菌水冲洗后，采用2％NaClO再消毒4min，以杀除老山参表面的细菌，避免细菌干扰人参细胞的培养作业。
[0025]老山参消毒作业结束后，采用无菌水再次冲洗表面，以清除老山参表皮的NaClO溶液，避免在切片过程中，NaClO溶液接触到参片的中部并腐蚀乃至破坏人参细胞的结构，以提升人参细胞培养作业的可靠性。无菌水冲洗后，将老山参置于包括PVP0.5％w/v、抗坏血酸100mg/L以及柠檬酸150mg/L的CS切削液中进行切片，以切成0.1
‑
0.2cm厚度的薄片，即参片，随后将参片置于如表1所示的BIM溶液，亦称褐变抑制培养基中进行超声波处理，超声波处理的频率为5kHz至100kHz；处理时间为0.1min至10min。
[0026]表1褐变抑制培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1人参细胞系诱导：对老山参消毒切片后进行超声波处理，并置于培养基中培养以诱导细胞生长；S2人参细胞系筛选：选择多种培养基并使用不同浓度、不同种类的激素进行细胞分离培养，筛选一种或几种生长形态较好、长势较快的细胞系，分别进行固体继代和液体悬浮培养；S3转化条件优化：采用多种不同浓度的弱酸对筛选的细胞系进行酸处理，并控制转化温度以及转化时间，检测干燥产物中的人参皂苷Rg3和Rh2，根据人参皂苷Rg3和Rh2总和量最高确定最优转化条件；S4大规模工业化生产：根据最优转化条件，对筛选的细胞系进行液体悬浮培养并对培养规模梯级放大，以获得产量高、转化后人参皂苷含量高的规模化工业生产的人参细胞产物。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S1中，消毒方式为削除流水洗净后的老山参的表皮，酒精浸泡消毒30s
‑
1min后采用浓度为0.5
‑
10％的NaClO消毒两次。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，NaClO消毒包括采用2％NaClO先消毒8min，经无菌水冲洗后，采用2％NaClO再消毒4min。4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，老山参在CS切削液中进行切片并在BIM溶液中进行超声波处理，CS切削液包括PVP0.5％w/v、抗坏血酸100mg/L以及柠檬酸150mg/L，BIM溶液包括WPM盐1/4含量、蔗糖1％w/v、PVP0.5％w/v、抗坏血酸100mg/L以及柠檬酸150m...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯丽丽，陈怀德，刘民宪，刘雨佳，凌远建，
申请(专利权)人：深圳先声科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：