本发明专利技术提供了通过以下方法获得的细菌乳酸乳球菌的改良菌株，所述方法包括将来自两种乳酸乳球菌亲本菌株的两个原生质体融合的步骤，当在需氧条件下培养时，所述乳酸乳球菌亲本菌株相比其所来源的乳酸乳球菌野生型菌株显示：(a)增加的产生乙偶姻和/或2,3‑丁二醇(2,3‑BDO)的能力，和(b)降低的产生乳酸的能力，并且其中当在需氧条件下培养时，所述乳酸乳球菌的改良菌株具有：增加野生型菌株产生量至少20倍的产生2,3‑BDO的能力；增加野生型菌株产生量至少20倍的产生乙偶姻的能力；以及降低野生型菌株产生量至少10倍的产生乳酸的能力。还提供了产生乙偶姻和2,3‑BDO的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生2,3-丁二醇和其他代谢物的细菌菌株本申请要求2016年7月19日递交的欧洲专利申请EP16382347.9的权益。专利
本专利技术属于可通过遗传操作获得的微生物领域。具体地，本专利技术涉及新的乳酸细菌菌株，其属于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)物种，特征在于较高的产生2,3-丁二醇和乙偶姻的能力，这些分子在化学、制药和生物燃料工业中具有广泛的应用。
技术介绍
2,3-丁二醇(2,3-BDO)是一种在燃料和化学品领域中显示巨大潜力的化学品，包括用作制备各种不同化学品中的结构单元。其可以用作溶剂、抗冻剂、液体燃料和用于制备许多合成聚合物和树脂的单体。其具有27,200Jg-1的热值，类似于乙醇(29,100Jg-1)和甲醇(22,100Jg-1)，这使得其适合作为液体燃料和燃料添加剂。此外，由于其较高的辛烷值，其可用作汽油的辛烷促进剂。2,3-BDO在印刷用油墨、香料、熏蒸剂、斯潘德克斯弹性纤维(spandex)、润湿剂和软化剂、增塑剂以及作为药物载体的制造中也具有另外的潜在应用。特别相关的是使用2,3-BDO作为结构单元，即作为前体用于合成有价值的工业化学品，包括乙偶姻和二乙酰、甲基乙基酮、2-丁醇、丁烯、1,3-丁二烯和塑料(聚酯、聚碳酸酯和聚氨酯)。其中，1,3-丁二烯值得特别关注，这是因为其为用于合成合成橡胶，主要是用于制造轮胎的单体。另外，上述衍生物中的一些可以通过寡聚化、缩合和氢化反应的方式转换成具有用作包括喷气燃料在内的(生物)燃料的潜能的高级烃。商业上，2,3-BDO的关键下游产品具有每年约3200万吨，销售额估价为约$430亿的潜在全球市场。当前，2,3-BDO的工业制造主要是通过复杂和昂贵的工艺的方式从石化原料制得。在炼油期间，在从裂解气体去除丁二烯和异丁烯后，获得了C4烃级分，称为C4萃余液II，其包含约77％的丁烯以及23％的丁烷和异丁烷的混合物。通过利用于水中的氯的溶液对该级分的氯醇化和随后的利用氢氧化钠对氯乙醇的环化，获得了以下组分的丁烯氧化物混合物：55％的反式-2,3-丁烯氧化物、30％的顺式-2,3-丁烯氧化物和15％的1,2-丁烯氧化物。于160-220℃，在50巴(bar)压力下，该混合物的水解产生丁二醇混合物，其通过真空分馏进行分离。通过该反应顺序，从反式-2-丁烯经反式-2,3-丁烯氧化物获得了meso-2,3-丁二醇；类似地从顺式-2-丁烯经顺式-2,3-丁烯氧化物形成了R,R-2,3-丁二醇和S,S-2,3-丁二醇的外消旋混合物。由于昂贵的化学合成，2,3-BDO目前是一个没有吸引力的细分市场。原材料价格和使用合成2,3-BDO的环境影响是全球2,3-BDO市场增长的主要障碍。由于这些担忧，趋势正转向寻找更为环境友好和更具成本竞争力的替代选择，并且其中2,3-BDO的生物生产显得地位突出(http://www.transparencymarketresearch.com；丁二醇(1,4BDO&2,3BDO)、1,3丁二烯和MEK市场：应用(THF、PU、PBT、SBR、ABS、NBR等)，基于生物的替代选择，下游潜力，市场大小和预报，2010–2018)。已知许多微生物能够产生2,3-BDO，但它们中的仅少数能够以可能被认为是工业相关的足够高的量产生2,3-BDO。最佳的生产者是属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和沙雷氏菌属(Serratia)的细菌，特别是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。参与2,3-BDO的生物合成的代谢途径始于糖代谢产生的丙酮酸，并且包括三个步骤。在第一步中，硫胺素依赖性的酶-α-乙酰乳酸合成酶催化两分子的丙酮酸缩合，产生α-乙酰乳酸分子并释放CO2分子。然后通过由α-乙酰乳酸脱羧酶催化的脱羧反应将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻。最后，使用NADH作为辅因子，通过乙偶姻还原酶/2,3-BDO脱氢酶将乙偶姻还原为2,3-BDO。关于通过发酵进行的2,3-BDO的工业规模生产，最佳生产者肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌是致病菌(二级危险群-RG2)的这一事实引起了强烈的担忧。工业规模的发酵工艺要求遵循严格的安全措施，这暗示使用RG2微生物是所述发酵工艺的工业发展的一个障碍。当发酵体积大于10L时，使用RG2微生物，必须采用合适的生物安全措施，包括生物安全水平第2等级大规模(BSL2-LS)安全壳(containment)设施设计和专门的操作规程。所有这些生物安全措施显著增加了生产成本，仅考虑安全壳水平的每增量的发酵罐基础成本，估计成本增加了10％-30％。因此，需要能够与上述的RG2细菌一样有效地产生2,3-BDO的RG1微生物(安全的)。已报导有几种RG1细菌能够产生2,3-BDO，但通常，对于经济工艺来说其效率非常低。一些重要的例外为细菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)(T.等人,“Enhancedfed-batchfermentationof2,3-butanediolbyPaenibacilluspolymyxaDSM365”Bioresourcetechnology2012,第124卷,pp.237-244)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(Ge,Y.等人,“Contractedbuteffective:productionofenantiopure2,3-butanediolbythermophilicandGRASBacilluslicheniformis”.GreenChemistry,2016)。作为替代，在以下菌中改造了2,3-BDO的产生：细菌大肠杆菌(Escherichiacoli)(Nielsen,D.R.等人,"MetabolicEngineeringofAcetoinandmeso-2,3-ButanediolBiosynthesisinE.coli.",Biotechnol.J.2010,第5卷,pp.274-284)，和酵母菌酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(Lian,J.等人,“MetabolicengineeringofaSaccharomycescerevisiaestraincapableofsimultaneouslyutilizingglucoseandgalactosetoproduceenantiopure(2R,3R)-butanediol”Metabolicengineering2014,第23卷,pp.92-99)。另一种考虑的可能性为使用RG1天然生产者，提高其2,3-BDO合成能力。在该最后的替代选择中，乳酸细菌乳酸乳球菌似乎是可能的候选物。乳酸乳球菌显示出可用于工业工艺中的几个有利特征：它具有尺寸较小的、良好表征的基因组，已经针对几种菌株对基因组进行了测序；对其遗传操作有各种各样的工具可供选择；其在需氧或厌氧条件下显示快速增长；其显示出较高的糖酵解通量；其具有相当简单的能量和碳代谢；其对于产生感兴趣的化学品有不同的代谢途本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.通过以下方法获得的细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的改良菌株，所述方法包括将来自两种乳酸乳球菌亲本菌株的两个原生质体融合的步骤，当在需氧条件下培养时，所述乳酸乳球菌亲本菌株相比其所来源的乳酸乳球菌的野生型菌株显示：(a)增加的产生乙偶姻和/或2,3‑丁二醇(2,3‑BDO)的能力，和(b)降低的产生乳酸的能力，并且其中当在需氧条件下培养时，所述乳酸乳球菌的改良菌株具有：增加野生型菌株产生量至少20倍的产生2,3‑BDO的能力，增加野生型菌株产生量至少20倍的产生乙偶姻的能力，以及降低野生型菌株产生量至少10倍的产生乳酸的能力。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.19 EP 16382347.91.通过以下方法获得的细菌乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的改良菌株，所述方法包括将来自两种乳酸乳球菌亲本菌株的两个原生质体融合的步骤，当在需氧条件下培养时，所述乳酸乳球菌亲本菌株相比其所来源的乳酸乳球菌的野生型菌株显示：(a)增加的产生乙偶姻和/或2,3-丁二醇(2,3-BDO)的能力，和(b)降低的产生乳酸的能力，并且其中当在需氧条件下培养时，所述乳酸乳球菌的改良菌株具有：增加野生型菌株产生量至少20倍的产生2,3-BDO的能力，增加野生型菌株产生量至少20倍的产生乙偶姻的能力，以及降低野生型菌株产生量至少10倍的产生乳酸的能力。2.如权利要求1所述的改良菌株，当在富含碳水化合物的培养基中于20-40℃，pH5.5-6.0和5％-100％溶氧浓度下培养时，所述改良菌株产生的2,3-BDO的量对应于总发酵产物的80％-95％，并且当在富含碳水化合物的培养基中于20-40℃，pH6.5-7.5和30％-100％溶氧浓度下培养时，所述改良菌株产生的乙偶姻的量对应于发酵产物的45％-80％。3.如权利要求1-2中任一项所述的改良菌株，其为以登录号CECT9139保藏于西班牙典型培养物保藏中心的菌株。4.如权利要求1-3中任一项所述的改良菌株，其中所述乳酸乳球菌亲本菌株中的每一种通过对其所来源的乳酸乳球菌的野生型菌株进行诱变处理而获得。5.如权利要求4所述的改良菌株，其中使用甲磺酸乙酯(EMS)进行所述诱变处理。6.如权利要求1-5中任一项所述的改良菌株，其中所述乳酸乳球菌的野生型菌株为乳酸乳球菌NCIMB702118。7.如权利要求1-6中任一项所述的改良菌株，其中当在需氧条件下培养时，相比所述乳酸乳球菌亲本菌株所来源的乳酸乳球菌的野生型菌株，所述乳酸乳球菌亲本菌株中的一种具有增加的产生乙偶姻的能力，并且另一种具有增加的产生2,3-丁二醇的能力。8.如权利要求1-7中任一项所述的改良菌株，其中进行所述原生质体融合步骤的两种乳酸乳...
【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·龙卡尔马丁内兹，苏珊娜·卡巴雷罗罗曼，玛利亚·德·玛·迪亚兹德古勒努扎巴特，伊内斯·伦琴阿罗约，苏拉娅·普列托费尔南德斯，约瑟·拉蒙·奥乔亚格梅兹，
申请(专利权)人：腾亚研创，
类型：发明
国别省市：西班牙,ES
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。