一种纯化卡里奇霉素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种纯化卡里奇霉素γ1

【技术实现步骤摘要】
一种纯化卡里奇霉素的制备方法
本专利技术属于医药
，具体涉及抗生素卡里奇霉素γ1I的纯化方法。
技术介绍
卡里奇霉素(Calicheamicin)是一种小分子脂溶性化合物，属于十元环烯二炔类抗肿瘤抗生素，是从一株稀有放线菌小单孢菌Micromonosporaechinosporasppcalichensis的发酵液中分离得到的，其主要活性成分为卡里奇霉素γ1I。卡里奇霉素具有很强的细胞毒性和抗肿瘤活性，能够嵌入DNA双螺旋的小沟中，引起DNA双链断裂从而杀死细胞。卡里奇霉素对多种肿瘤细胞均有强烈的杀伤作用，是迄今为止发现的活性最强的一类抗肿瘤抗生素。由于卡里奇霉素抗肿瘤作用极强，分子较小，已被作为一种单克隆抗体的“弹头”应用于临床。卡里奇霉素γ1I的结构式如下：有关报道卡里奇霉素的文献有美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.,1987,109:3464-3466；J.Am.Chem.Soc.,1987,109:3466-3468)；日本抗生素杂志(J.Antibiotics.,1989,42:558-563；J.Antibiotics.,1989,42:1070-1087.)；以及中国专利CN101591632A等。这些文献报道了卡里奇霉素的理化性质、生物活性、发酵与分离纯化等内容。现有技术未涉及到大规模制备得到99％以上纯度的卡里奇霉素γ1I，因此急需一种可大规模制备的、高纯度的卡里奇霉素γ1I的制备方法，使其符合药品生产要求。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种环境友好、工艺简单的、可大规模实施的纯化卡里奇霉素γ1I的方法，本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种纯化卡里奇霉素γ1I的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将卡里奇霉素γ1I粗品进行正相制备柱层析，用有机溶剂进行洗脱，收集并合并含有卡里奇霉素γ1I的洗脱液；(2)从步骤(1)所得洗脱液中分离得到卡里奇霉素γ1I精制品。其中，步骤(1)所述的正相制备柱层析的制备柱填料为华谱X5正相填料,华谱X5正相填料是一种能重复利用的球形多元醇基键合相硅胶。步骤(1)所述的有机溶剂为乙酸乙酯-甲醇溶剂系统或二氯甲烷-甲醇溶剂系统，优选为乙酸乙酯-甲醇＝100:1-10(V:V)，或二氯甲烷-甲醇＝100:1-10(V:V)的溶液，更优选为二氯甲烷-甲醇＝100:3-6(V:V)的溶液。其中，步骤(1)中，收集并合并卡里奇霉素γ1IHPLC纯度≥99％的洗脱液。其中，步骤(1)所述卡里奇霉素γ1I粗品是由以下方法制备得到的：(a)将含有卡里奇霉素γ1I的发酵液进行预处理，得到含有卡里奇霉素γ1I的溶液；(b)将步骤(a)所得卡里奇霉素γ1I的溶液进行浓缩，得到含有卡里奇霉素γ1I的浓缩液1；(c)步骤(b)所得浓缩液1经过洗涤液洗涤后得到含有卡里奇霉素γ1I的有机相，将该有机相继续浓缩得到浓缩液2；(d)步骤(c)所得到的浓缩液2经过沉淀溶剂沉淀，过滤得到卡里奇霉素γ1I粗品。其中，步骤(a)所述的预处理包括以下步骤：将含有卡里奇霉素γ1I的发酵液用0.5-2倍发酵液体积的有机溶剂进行混合，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或醋酸异丙酯，优选乙酸乙酯；然后将所得的混合物进行离心或过滤后分层，得到含有卡里奇霉素γ1I的有机溶液。其中，步骤(b)所述的浓缩使用的方法是单罐浓缩或者刮板浓缩，浓缩至原体积的三分之一到四分之一。其中，步骤(c)中，所述的洗涤液为0.5％kg/L氢氧化钠溶液或者2-5％kg/L碳酸钠溶液，优选2-5％kg/L碳酸钠溶液；所述的洗涤液的体积与浓缩液1的体积比为0.5-2:1；所述的浓缩液1与浓缩液2的体积比为10-20:1。其中，步骤(d)中，所述的沉淀溶剂为正庚烷或正己烷，优选正己烷；所述的沉淀溶剂的体积为浓缩液2体积的3-5倍。本专利技术的优势在于：本专利技术在卡里奇霉素γ1I粗品的制备过程中，将含有卡里奇霉素γ1I的发酵液采用萃取、洗涤、沉淀后，可以将发酵液中含量只有20-60mg/L的卡里奇霉素γ1I提高到含量70％以上；本专利技术提供了采用正相制备柱层析纯化卡里奇霉素的方法，该方法选用华谱X5正相填料(即球形多元醇基键合相硅胶)的制备柱，使得杂质和卡里奇霉素γ1I得到有效分离，得到的卡里奇霉素γ1IHPLC纯度≥99％，制备收率≥90％。另外，本专利技术所用有机溶剂可回收重复使用，三废排放少，环境友好，符合当今医药生产趋势和要求；此外，该方法工艺简单，是可大规模实施的纯化卡里奇霉素γ1I的方法，其符合药品生产要求。附图说明图1实施例1中的卡里奇霉素γ1I发酵液HPLC图谱图2实施例1制备得到的卡里奇霉素γ1I粗品HPLC图谱图3实施例1制备得到的卡里奇霉素γ1I精制品HPLC图谱具体实施例本专利技术所用制备柱购自北京创新通恒科技有限公司；华谱X5正相填料购自浙江华谱新创科技有限公司；高效液相色谱仪为岛津LC2010HT；碟式分离机为江苏巨能机械有限公司DHC211。制备卡里奇霉素γ1I粗品所用的乙酸乙酯、碳酸钠为市售工业级；制备用甲醇、二氯甲烷为分析级。本专利技术制备例中的产卡里奇霉素γ1I菌株为棘孢小单孢菌M.echinospora在CN102732580A中公开过，公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。本专利技术测定卡里奇霉素γ1I含量及色谱纯度的方法采用高效液相色谱法，具体方法如下：岛津LC2010HT液相系统和AgilentZORBAXSB-C18(5um,250×4.6mm)色谱柱，流动相为0.01mol/L甲酸铵：95％乙腈＝45:55(V/V),检测波长为230nm,洗脱流速为1ml/min。进样量为10μL。制备例：本专利技术发酵液培养过程如下：(1)平板菌落的制备与培养平板采用ISP2培养基(g/L)：葡萄糖4，酵母抽提物4，麦芽抽提物10，琼脂20，蒸馏水1000mL，pH7.0，灭菌压力1.05kg/cm2，20min，冷却到50-60℃倒平板。分离单菌落，经28±1℃培养5-7天后点种，点种的平板27-29℃培养8-13天。(2)摇瓶种子液的制备与培养种子培养基配方(g/L)：蔗糖4，甘露醇14，酵母膏6，酵母抽提物6，碳酸钙4，pH7.0，摇瓶装液量为25mL/250mL，经121℃灭菌30分钟。挑取单菌落于2.0ml玻璃珠水管内震荡打散(约10-15min)，每瓶种子接入1/2颗单菌落(即1ml菌悬液)，种子置于(240-260)转/分摇床上，于(26-30)℃培养(40-48)小时，pH约6.8-7.3，菌浓14-22％，粘度(16s)约120cps。(3)种子罐种子液的制备在120L种子罐中投入100L的种子培养基(培养基配方(g/L)：蔗糖4，甘露醇14，酵母膏6，酵母抽提物6，碳酸钙4，pH7.0，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下30分钟，待冷却后，接入1-6L摇瓶种子液，培养温度为28±2℃，搅拌转速200rpm，空气流量1.0-3.5m3/h，培养40-96小时.(4)发酵罐培养基的配制与培养发酵培养基配方(g/L)：蔗糖5，麦芽糊精12，豆粕10，酵母膏6，大豆蛋白胨10，豆油4，七水合硫酸镁0.2，碳酸钙4，树脂30，pH7.0，投料体积为1200L，pH7.0，于121℃条件下蒸汽灭菌20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化卡里奇霉素γ1I的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将卡里奇霉素γ1I粗品进行正相制备柱层析，用有机溶剂进行洗脱，收集并合并含有卡里奇霉素γ1I的洗脱液；(2)从步骤(1)所得洗脱液中分离得到卡里奇霉素γ1I精制品。

【技术特征摘要】
1.一种纯化卡里奇霉素γ1I的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将卡里奇霉素γ1I粗品进行正相制备柱层析，用有机溶剂进行洗脱，收集并合并含有卡里奇霉素γ1I的洗脱液；(2)从步骤(1)所得洗脱液中分离得到卡里奇霉素γ1I精制品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述卡里奇霉素γ1I粗品是由以下方法制备得到的：(a)将含有卡里奇霉素γ1I的发酵液进行预处理，得到含有卡里奇霉素γ1I的溶液；(b)将步骤(a)所得卡里奇霉素γ1I的溶液进行浓缩，得到含有卡里奇霉素γ1I的浓缩液1；(c)步骤(b)所得浓缩液1经过洗涤液洗涤后得到含有卡里奇霉素γ1I的有机相，将该有机相继续浓缩得到浓缩液2；(d)步骤(c)所得到的浓缩液2经过沉淀溶剂沉淀，过滤得到卡里奇霉素γ1I粗品。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的预处理包括以下步骤：将含有卡里奇霉素γ1I的发酵液用0.5-2倍发酵液体积的有机溶剂进行混合，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或醋酸异丙酯，优选乙酸乙酯；然后将所得的混合物进行离心或过滤后分层，得到含有卡里奇霉素γ1I的有机溶液。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述的浓缩使用的方法是单罐浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永健，周稳，应雪肖，梁陈宏，张俊，叶美丽，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33