RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，提供了RTL1基因以及RTL1基因超表达载体在调控成肌细胞增殖和分化中的应用，所述RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖和分化的作用；本发明专利技术明确了RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖和分化的作用，为今后进一步研究了RTL1在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下了基础。

【技术实现步骤摘要】
RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用。
技术介绍
RTL1基因(反转录转座子1基因，retrotransposon-like-1)，又名父本表达基因11(paternallyexpressedgene11,Peg11),在人和小鼠中为父本表达的印记基因，没有内含子序列。RTL1基因在胚胎和胎盘组织中表达量很高，对母体胎盘与胎儿的营养传递起着重要作用，敲除该基因的小鼠表现为胎儿死亡率升高、新生儿生长停滞、胎盘尺寸偏小；与人的胎儿发育和新生儿的生长也有密切关系。C2C12细胞是由小鼠骨骼肌卫星细胞永生化而来的细胞株，保持着一定的增殖和分化能力，且细胞形态和特性均一，可无限代培养，体外培养的C2C12成肌细胞能在低血清诱导条件下分化为多核的肌管，并表达Myogenin和Myosin等成熟骨骼肌的各种标志蛋白，因此C2C12细胞通常成为体外研究成肌细胞增殖和分化能力的首选模型。目前只知道RTL1基因与人的胎儿发育有关，关于RTL1基因在C2C12细胞中具有什么作用尚不清楚。因此，明确RTL1基因在C2C12细胞中的作用，不仅能为研究肌肉发育的表达调控机制提供新思路，更为今后进一步研究RTL1基因在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的新用途，明确了RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖和分化的作用，为今后进一步研究了RTL1在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下了基础。为实现上述目的，本专利技术是这样实现的：本专利技术的目的之一在于提供RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用。具体地，所述RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖的作用。具体地，所述RTL1基因具有促进成肌细胞的分化的作用。本专利技术的目的之二在于提供RTL1基因超表达载体在促进成肌细胞增殖、分化中的应用。具体地，所述RTL1基因超表达载体为pcDNA3.1-RTL1，是将小鼠RTL1基因完整编码区序列插入到pcDNA3.1载体的EcoRV和XbaΙ两个酶切位点之间得到。以上将小鼠RTL1基因分为上半部分和下半部分进行扩增，其中所述上半部分的引物对，RTL1-F：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，RTL1-CR:核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述下半部分的引物对，RTL1-CF：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，RTL1-R:核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术具有的有益效果是：1、实施例1中，利用荧光定量PCR检测C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因mRNA水平的表达情况，证实，随着C2C12细胞的分化，RTL1基因的表达量显著升高，其表达量变化趋势与成肌分化标志性基因相一致，肌细胞的分化程度越高，RTL1基因mRNA水平的表达越高；利用WesternBlot检测C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因蛋白水平的表达情况证实随着C2C12细胞的分化，RTL1基因的表达量逐渐升高，与mRNA表达水平结果一致。2、实验例2证明超表达载体pcDNA3.1-RTL1转染进细胞超表达RTL1后可以促进小鼠成肌细胞C2C12细胞的增殖与分化。3、实验例3证明siRNA抑制RTL1表达后可以抑制小鼠成肌细胞C2C12细胞的增殖与分化。4、本专利技术人通过以上正实验(实施例2过表达)、反实验(实施例3siRNA干扰实验)的结果证实，RTL1基因在成肌细胞增殖分化过程中具有重要调控作用：RTL1基因能够显著抑制成肌细胞的增殖和分化。此现象重复性强，结果可靠，为今后进一步研究RTL1在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下了基础。且RTL1基因是促进肌肉分化的，那么我们抑制它，就可以抑制肌肉过度肥大，因而对肉质性状的改良及肌肉发育相关疾病的治疗具有一定的意义，在猪的肉质改良上，不能过度追求瘦肉率，还要考虑到肉的风味，肥瘦相间的肉比较好吃，所以现在有的时候要控制瘦肉，增加一定量的脂肪，RTL1基因作为靶标，抑制RTL1基因的小分子抑制剂则可以控制瘦肉率；在疾病上来说，RTL1基因作为靶标，抑制RTL1基因的小分子抑制剂则可以治愈一些肌肉肥大症，可以应用于制备预防和/或治疗肌肉肥大症产品。附图说明图1为MyoG、MyHC、RTL1基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化图；其中1A为MyoG基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化图；1B为MyHC基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化图；1C为RTL1基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化图。图2为C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因蛋白水平的表达情况；图3为超表达载体pcDNA3.1-RTL1的PCR扩增结果见图3，其中3A为上半部分扩增结果，其中M为MarkerDL2000，3B为下半部分扩增结果，其中M为MarkerDL5000；图4为小鼠成肌细胞诱导分化后，成肌分化标志基因MyHC的免疫荧光染色图；其中上面一排为转染有超表达载体pcDNA3.1-RTL1的小鼠成肌细胞的免疫荧光染色图；下面一排为转染有空表达载体pcDNA3.1的小鼠成肌细胞的免疫荧光染色图；图5为MTT法检测小鼠成肌细胞的增殖率；其中上面一排为转染有超表达载体pcDNA3.1-RTL1的小鼠成肌细胞的增殖率；下面一排为转染有空表达载体pcDNA3.1的小鼠成肌细胞的增殖率；图6为siRNA干扰RTL1基因后抑制成肌细胞增殖的效果图；图7为siRNA干扰RTL1基因后抑制成肌细胞分化的效果图；其中图(A)为荧光定量PCR检测成肌细胞分化标志性基因MyoGmRNA表达水平的变化图；(B)为为荧光定量PCR检测成肌细胞分化标志性基因MyHCmRNA表达水平的变化图；图8为siRNA干扰RTL1基因后采用WesternBlot从蛋白水平检测成肌细胞分化标志性基因MyoG和MyHC表达量变化图。具体实施方式实施例1RTL1基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化1、利用荧光定量PCR检测C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因mRNA水平的表达情况未分化的C2C12细胞以含有10％FBS的高糖DMEM培养基培养。当细胞长至60％–70％汇合度时，换成2％马血DMEM培养基诱导其成肌分化。分别在诱导分化的0d、2d和6d收集细胞。Trizo1提取总RNA，TaKaRaPrimerScriptRT反转录试剂盒进行反转录(具体操作过程见参照试剂盒使用说明)，采用Bio-Rad公司的SYBRGreen荧光染料，Roche公司LightCycler480荧光定量PCR仪，以β-actin作为内参，进行荧光定量PCR实验，用2-ΔΔCt法计算每个基因的相对mRNA表达量，每组实验做3个平行，每个实验重复三次：反应体系为20μ1；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃，15s循环40次。其中用于荧光定量PCR检测RTL1基因的引物序列如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用。

【技术特征摘要】
1.RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖的作用。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RTL1基因具有促进成肌细胞的分化的作用。4.一种RTL1基因超表达载体在调控成肌细胞增殖和分化中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述RTL1基因超表达载体为pcDNA3.1-RTL1，是将小鼠RTL1基因完整编码区序...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔木，武华玉，彭先文，季子云，吴俊静，梅书棋，刘贵生，周佳伟，孙华，宋忠旭，胡华，李良华，董斌科，赵海忠，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42