一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种固相萃取结合UPLC‑MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法。该方法将乙腈/水/甲酸溶液与板栗样品混合，离心后上清液中加入无水硫酸镁、氯化钠、C18粉和柠檬酸钠混匀后进行二次离心，上清液过滤后采用UPLC‑MS/MS对T‑2毒素、青霉酸、伏马毒素B1、B2、B3、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮这14种毒素进行检测。该方法回收率高、灵敏度高、重复性好，在36个采集的板栗样品中有17个样品中检测出7种毒素，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法
本专利技术涉及一种快速测定板栗中14种毒素的方法，属于农产品检测

技术介绍
霉菌毒素是霉菌在生长过程中产生的对动物、人类和农作物有较大毒性的次生代谢产物。霉菌毒素可在农作物大田收获时形成；在不适宜的贮存条件下，霉菌毒素也可在收获后的农作物上形成。较高的湿度通常有利于霉菌的生长和霉菌毒素的产生。温度是另一个重要的因素，高温下的农作物很容易遭受霉菌孢子的侵害，一旦条件允许，霉菌孢子可产生霉菌毒素。霉菌毒素主要是由三类真菌产生，即曲霉、青霉和镰刀菌。它们所产生的真菌毒素，如黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马毒素B1、B2、B3、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A，由于其普遍存在及其对人体健康的影响，已成为全球关注的问题。而木本坚果是比较容易被霉菌毒素污染的作物品种，它们暴露于日常的外界环境中，而这种环境也十分有利于霉菌的生长和毒素的产生。板栗是一种传统农产品，种植区域十分广泛，但主要集中在欧洲和亚洲地区。板栗营养价值丰富，由42.2-66.5％的淀粉、40.3-60.1％的水、9.5-23.4％的总糖、4.8-9.6％的粗蛋白、2.2-3.7％的粗脂肪、1.8-3.4％的灰分、2.8-3.2％的脂肪、必须氨基酸和矿物质组成。而板栗丰富的营养也导致其容易在储藏和收获的过程中受到霉菌感染。霉菌会产生霉菌毒素，污染板栗，从而影响人体和动物的健康。不适当的农业收获方式以及不适当的储藏条件都会促使霉菌的生长，提高霉菌毒素的污染风险。为了保持板栗的原味，通常不会做成板栗粉。即使加工成板栗粉，在作坊式的晒干过程中板栗的污染也会非常严重。此外，霉菌通常适于在亚热带和暖温带气候中生存，山东处于暖温带季风气候，极为适于霉菌生存。到目前为止，板栗中还未被报道过伏马毒素、青霉酸等毒素。但是作为木本坚果，板栗是否也容易被别的霉菌毒素感染我们还不能确定，所以对板栗进行多种毒素的残留分析十分有必要。霉菌毒素的检测方法有很多，如酶联免疫法(ELISA)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、超高效液相色谱-质谱联用法。薄层色谱法和酶联免疫法通常用于作为定性和半定量检测，用于一种或者少数几种毒素的初步测试；气相色谱-质谱联用法在进样前通常需要对样品进行衍生化处理，其使用范围具有一定的局限性；而超高效液相色谱-质谱联用法由于其灵敏度高、特异性强、可靠性高等优势，日益成为广泛进行霉菌毒素分析的方法。近年来，也有不少使用超高效液相色谱-质谱联用法进行霉菌毒素测定的报道，但是这些检测方法仅适用于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A等常规真菌毒素，不能检测T-2毒素、青霉酸、伏马毒素B1、B2、B3、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等有可能出现在板栗中的真菌毒素。比如专利号为201410125596.8的中国专利公开了一种同时检测芝麻酱中多种霉菌毒素的方法，其虽然也是使用超高效液相色谱-串联质谱法，但其前处理方法繁琐，检出限和定量限高，灵敏度低，并且提取步骤比较繁琐，FB1、FB2、FB3的回收率较低，且并没有检测青霉酸。此外，不同的样品的预处理步骤对检测方法也有一定的影响，因此，一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确，能够同时快速测定板栗中多种霉菌毒素残留量的检测方法亟待开发出来。
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供了一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法。该方法使用优化的QuEChERS方法进行样品的预处理，建立了一种可以同时测定T-2毒素(T-2)、青霉酸(PCA)、伏马毒素B1(FB1)、B2(FB2)、B3(FB3)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、赭曲霉毒素A(OTA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3Ac-DON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15Ac-DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN))的高效液相色谱-串联质谱法，该方法的回收率高、灵敏度高、重复性好，可以为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。本专利技术的技术方案是：一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，包括以下步骤：1)对待测板栗样品进行提取以体积比为79:20:1的乙腈/水/甲酸溶液与板栗样品混合，离心后获得上清液为样品提取液；优选的，称取5g的板栗样品加入10ml的乙腈/水/甲酸溶液中；离心，取5ml上清液为样品提取液；2)对样品提取液进行预处理在步骤1)所获得的样品提取液中加入0.2g/ml无水硫酸镁，0.1g/ml氯化钠，0.02g/mlC18粉，0.02g/ml的柠檬酸钠混匀后进行二次离心，上清液过滤后获得样品分析液；优选的，取5ml样品提取液加入1g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，0.1gC18粉，0.1g柠檬酸钠，快速震荡混匀，离心；上清液过滤后获得样品分析液；3)检测采用UPLC-MS/MS对步骤2)中获得的样品分析液进行14种霉菌毒素的定性和定量分析。进一步的，所述14种毒素为T-2毒素、青霉酸、伏马毒素B1、B2、B3、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮。进一步的，所述步骤3)中UPLC-MS/MS色谱条件如下：色谱条件：watersI-class超高液相色谱仪，UPLCBEH-C18柱(100×2.1mm2I.D，1.7μm)，流动相A：0.5％甲酸水，流动相B：甲醇，流速：0.3mL/min。梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相A和流动相B体积比为90：10；1-3min流动相B从10％线性增加到30％，平衡1min；4-6min流动相B从30％线性增加到50％，平衡1min；7-9min流动相B从50％线性增加到70％，平衡1min；10-11min流动相B从70％线性增加到90％，平衡3min；14-15min流动相B从90％线性减少到10％，平衡1min。质谱条件：AB5500型三重四级杆串联质谱仪，电喷雾(ESI)离子源，正负离子扫描模式；各参数如下：离子喷雾电压：4.5kV，气帘气压力：15psi，雾化气压力：50psi，辅助加热气压力：50psi，离子源加热温度：550℃。利用多反应监测模式(MRM)检测。进一步的，所述14种菌毒素中，正离子条件下可检测的毒素为：T-2毒素、伏马毒素B1、B2、B3、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇。负离子条件下可检测的毒素为青霉酸、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮。本专利技术的有益效果：1、本专利技术前处理采用了固相萃取净化技术，方法简便快捷，同时结合灵敏度高的UPLC-MS/MS技术建立了能够同时分析板栗中14种霉菌毒素的分析方法。2、本专利技术比较了10种前处理方法，最终选择了改良的QuEChERS方法，用固相分散技术，采用加酸的提取溶剂对极性差别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固相萃取结合UPLC‑MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述14种毒素为：T‑2毒素，青霉酸，伏马毒素B1、B2、B3，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，15‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮，其测定方法包括以下步骤：1)对待测板栗样品进行提取将乙腈/水/甲酸溶液与板栗样品混合，离心后获得上清液为样品提取液；2)对样品提取液进行预处理在步骤1)所获得的样品提取液中加入无水硫酸镁，氯化钠，C18粉和柠檬酸钠混匀后进行二次离心，上清液过滤后获得样品分析液；3)检测采用UPLC‑MS/MS方法对步骤2)中获得的样品分析液进行14种霉菌毒素的定性和定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述14种毒素为：T-2毒素，青霉酸，伏马毒素B1、B2、B3，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮，其测定方法包括以下步骤：1)对待测板栗样品进行提取将乙腈/水/甲酸溶液与板栗样品混合，离心后获得上清液为样品提取液；2)对样品提取液进行预处理在步骤1)所获得的样品提取液中加入无水硫酸镁，氯化钠，C18粉和柠檬酸钠混匀后进行二次离心，上清液过滤后获得样品分析液；3)检测采用UPLC-MS/MS方法对步骤2)中获得的样品分析液进行14种霉菌毒素的定性和定量分析。2.如权利要求1所述的一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述步骤1)乙腈/水/甲酸溶液的体积比为79:20:1；所述步骤2)中，在步骤1)所获得的样品提取液中加入0.2g/ml无水硫酸镁，0.1g/ml氯化钠，0.02g/mlC18粉和0.02g/ml的柠檬酸钠。3.如权利要求1或2所述的一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述步骤3)中UPLC-MS/MS中的色谱柱为：UPLCBEH-C18柱。4.如权利要求3所述的一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述步骤3)中所述UPLC-MS/MS中的流动相A：0.5％甲酸水，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相A和流动相B体积比为90：10；1-3min流动相B从10％线性增加到30％，平衡1min；4-6min流动相B从30％线性增加到50％，平衡1min；7-9min流动相B从50％线性增加到70％，平衡1min；10-11min流动相B从70％线性增加到90％，平衡3min；14-15min流动相B从90％线性减少到10％，平衡1min。5.如权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁京芸，赵善仓，王磊，董燕婕，范丽霞，苑学霞，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37