快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的特异性引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的特异性引物、试剂盒和检测方法。引物序列如下：EcUP：5'‑TCAACGCCAAGCCGATTTCT‑3'；EcNP：5'‑ACGAATGAACCGTCGTCGGC‑3'。本发明专利技术建立了一种特异性检测兰花细菌性褐腐病菌的检疫鉴定方法，为检疫兰花细菌性褐腐病菌建立标准和依据，有助于加强口岸对兰花细菌性褐腐病菌的寄主植物检验检疫，杜绝兰花细菌性褐腐病菌通过口岸传入我国，避免其在我国境内扩散。本发明专利技术的建立的方法比传统的鉴定方法更快速，特异性更强，灵敏度更高，引物鉴定的DNA灵敏度约为0.01ng/μl。

【技术实现步骤摘要】
快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的特异性引物、试剂盒和检测方法
本专利技术涉及一种快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的特异性引物、试剂盒和检测方法，属于微生物检测鉴定

技术介绍
兰花细菌性褐腐病菌(Erwiniacypripedii)为肠杆菌科欧文氏菌属（Erwinia）的植物病原细菌，Erwinia属是由细菌学家ErwinF.Smith命名于1920年，其绝大多数成员是植物致病菌，有些成员在植物表面的非植物致病菌的生态群众是一个重要组成，少数菌系是人类和动物的机遇性病原菌。分类变化较大，被多数人认可的是分为3个组：amylovora组、carotovora组、herbicola组。1945年，Waldee提出软腐类欧文氏菌应为一个单独的属——Pectobacterium属，然而，由于缺乏证据支持，直到1980年才被认可，其主要成员来自carotovora组。目前，Pectobacterium属下包括carotovora组的9个种/亚种：P.atroseptica、P.betavasculorum、P.carotovorasubsp.Carotovora、P.carotovorasubsp.Brasiliense、P.carotovorasubsp.Odorifera、P.wasabiae、P.parmentieri、P.cacticida、P.cypripedii。2010年，Brady等人通过MLSA等方法提出将P.cypripedii划为泛菌属（Pantoea）。在最新版《伯杰氏系统细菌学手册》中该菌为Pectobacterium(Erwinia)cypripedii。兰花细菌性褐腐病菌主要分布于南非、日本、澳大利亚、美国及我国台湾，可通过植株进行远距离传播，严重危害兰科植物引起褐腐病，一般侵染兰科植物肉质叶片，开始为小水浸状斑，然后扩展并微凹陷，淡褐色油浸状，并扩展到茎和生长点，是危害兰花的一种很重要的细菌病害。马来西亚将该病菌列为检疫性植物有害生物。随着贸易的发展，近年来我国引进兰花品种和数量大幅度增加，新病害传入的风险日益增大，由于该病菌可通过寄主植株进行远距离传播，因此传入国内对农业生产、生态安全造成危害的风险较高，目前我国口岸已多次从入境的商品及旅客携带的植物产品中截获该病菌，国家质检总局多次下达警示通报，并在“关于进口大花惠兰植物检验检疫要求的公告”[2014年第131号]中“输华植物检疫要求议定书”里将该病菌列为禁止入境的有害生物。为保护我国农业生产生态安全，有效防止细菌病害蔓延，加强该病菌快速检测方法的研究具有重要意义。在研究检测鉴定方法时，该菌常与Erwinia属中的同样能够引起兰科植物软腐病的菊基腐病菌（E.chrysanthemi）和胡萝卜软腐病菌（E.carotovoravar.carotovora）进行生理、生化和培养特征的鉴别。目前关于E.chrysanthemi和E.carotovoravar.carotovora已经开展的快速检测方法研究相对比较多，但是兰花细菌性褐腐病菌的检测鉴定方法罕见报道。在口岸检疫鉴定过程中，一般还只局限于传统的培养基筛选、生理生化鉴定，并需进行致病性测定等冗长的步骤，其检测步骤繁杂，时间冗长甚至超出植株存活允许的时间范畴等缺陷，目前关于兰花细菌性褐腐病菌的鉴定技术有：（1）生理生化指标测定，这是鉴定细菌最传统可靠的方法，要求必须先从寄主植物中分离出病原菌，经过病菌纯化，再结合属、种的各项生理生化特征进行一一测定比对，对于日常口岸鉴定该方法存在两个不足：一是鉴定步骤繁杂，需要较长的前处理时间，时间冗长，二是即使借助快速生理生化鉴定仪，也只是生理生化指标的初筛比对，不能对病菌实现终极判定。（2）16SrDNA基因序列分析，是指利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤，是一种有效、可靠的病原细菌鉴定方法，但有的菌种由于种间差异小，单独依靠16SrDNA鉴定不能鉴定到种，需要再结合其它鉴定方法，往往作为辅助鉴定手段，无法满足日常口岸快速准确灵敏鉴定的工作需求。目前，针对兰花细菌性褐腐病菌的快速检疫鉴定还没有方法也没有相应的国家标准、行业标准。国内外针对兰花细菌性褐腐病菌的检测没有采用特异性的分子生物学方法（如PCR-凝胶电泳、实时荧光PCR等）的检测方法报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的特异性引物、试剂盒和检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术设计了一组快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的特异性引物，引物序列如下：EcUP：5'-TCAACGCCAAGCCGATTTCT-3';EcNP：5'-ACGAATGAACCGTCGTCGGC-3'。本专利技术还提供一种快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的试剂盒，包括PCR扩增反应液、阳性对照DNA两部分：PCR扩增反应液总体积为25μL，其中含：2μL的样品DNA10μg/mL-100μg/mL，10μM上EcNP各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μl，10μmol/LdNTP2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，水补足至总体积25μL；涉及的PCR扩增检测用的引物序列如下：EcUP：5'-TCAACGCCAAGCCGATTTCT-3';EcUP：5'-ACGAATGAACCGTCGTCGGC-3'；阳性对照DNA为含有兰花细菌性褐腐病菌的DNA提取液。本专利技术还提供一种快速检测兰花细菌性褐腐病菌的方法，依次包括下列步骤：（1）待检样品DNA的提取采用改良的CTAB法或适用的商品化试剂盒进行DNA提取；（2）PCR扩增A.采用25μLPCR反应体系：PCRPremix(2X)12.5μL，H2O8.5μL，10μM引物各1μL，DNA模板2.0μL；PCRPremix里面包括的成分：0.1UTaqpolymerase/μL，500μMDNTPeach，20mMTris-HCL(PH8.3)，100MmKCl，3mMgCl。B.将PCR反应管放入PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：PCR反应条件：预变性：98℃，2min；（变性：98℃，10s；退火：59.4℃，10s；延伸：72℃，10s）35循环；延伸：72℃，3min。。本专利技术的有益效果：建立了一种快速检测兰花细菌性褐腐病菌的检疫鉴定方法，为检疫兰花细菌性褐腐病菌建立标准和依据，有助于加强口岸对兰花细菌性褐腐病菌的寄主植物检验检疫，杜绝兰花细菌性褐腐病菌通过口岸传入我国，避免其在我国境内扩散。本专利技术的建立的方法比传统的方法特异性更强，灵敏度更高，引物鉴定的DNA灵敏度约为0.01ng/μl。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1是兰花细菌性褐腐病菌特异性检测结果。M：DL5000DNAMarker；0:ddH2O;1：兰花细菌性褐腐病菌;2:菊基腐病菌;3:胡萝卜软腐病菌;4:梨火疫病菌;5:成团泛菌;6：菠萝泛菌。图2是兰花细菌性褐腐病菌引物灵敏度验证检测结果。注：M：DL5000DNAMarker；1：DNA原液；2：10-1；3:10-2；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的特异性引物，其特征在于，引物序列如下：EcUP：5'‑ TCAACGCCAAGCCGATTTCT ‑3';EcNP：5'‑ ACGAATGAACCGTCGTCGGC ‑3'。

【技术特征摘要】
1.快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的特异性引物，其特征在于，引物序列如下：EcUP：5'-TCAACGCCAAGCCGATTTCT-3';EcNP：5'-ACGAATGAACCGTCGTCGGC-3'。2.快速鉴定兰花细菌性褐腐病菌的试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增反应液、阳性对照DNA两部分：PCR扩增反应液总体积为25μL，其中含：2μL的样品DNA10μg/mL-100μg/mL，10μM上EcNP各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μl，10μmol/LdNTP2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，水补足至总体积25μL；涉及的PCR扩增检测用的引物序列如下：EcUP：5'-TCAACGCCAAGCCGATTTCT-3';EcNP：5'-ACGAATGAACCGTCGTCGGC-3'；阳性对照DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：厉艳，魏晓棠，张京宣，静平，房保海，邵秀玲，封立平，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37