用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个基因靶点(例如SHOX2、HOXA9和TAC1)的甲基化状态来用于肺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，经实验测试，本发明专利技术试剂盒可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。

DNA methylation qPCR kit for lung cancer detection and its application

The invention belongs to the field of biotechnology and DNA detection technology, in particular to a DNA methylation qPCR kit for lung cancer detection and its use method, in particular to a kit for lung cancer detection or screening by methylation qPCR using plasma free DNA to determine the methylation status of one or more gene targets (such as SHOX2, HOXA9 and TAC1) and its use method. The detection sensitivity of the kit can be improved to Pick/Nake DNA molecule by optimizing specific nucleotide sequence primers and DNA probes and improving bisulfite treatment of plasma free DNA.

【技术实现步骤摘要】
用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
本专利技术属于生物技术和DNA检测
，尤其涉及一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个基因靶点(例如SHOX2、HOXA9和TAC1)的甲基化状态来用于肺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，此外，本专利技术还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。
技术介绍
肺癌是全世界范围内的主要死亡原因之一。据美国癌症协会统计，2018年仅在美国就有大约234030例新发肺癌病例和154050例肺癌死亡病例，估计肺癌死亡人数大约相当于结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病和非霍奇金淋巴瘤死亡人数的总和。目前针对肺癌的治疗，早期诊断的非转移性肿瘤多采用手术和放射疗法，后期癌症采用化学疗法和放射疗法的组合，更晚期或终末期癌症则采用化学疗法结合靶向疗法。临床数据显示，I-II期肺癌患者的5年总生存率为30-49％，而III期及以后则为1-14％。由此可见，早期发现及时治疗对肺癌患者的预后及生存期具有重要的影响，然而目前的临床现实是，由于受到诊断手段的限制，大多数患者在晚期才被诊断出来，从而丧失了最佳的治疗窗口。临床中肺癌的初步诊断和分期主要通过CT扫描对肺结节进行判断，而进一步的细胞和分子表型诊断则必须通过细针抽吸或胸腔镜等侵入性方法予以实施，因此，利用微创方法辅助早期诊断在临床上有着极为广阔的应用前景。DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。在众多基因中，CpGs的高甲基化，特别是在SHOX2，TAC1和HOXA9中，已被认为是肺癌的生物标志物，因此，对这些基因中的一种或多种的甲基化状态进行分析可用于诊断肺癌的状态。目前在早期检测和筛查肺癌方面存在的主要挑战在于取得检测样本组织所需实施的侵入性活检方法。毫无疑问，液体活组织检查是该问题理想的解决方案，其中用于分析的生物样品可以从血液、尿液、唾液、痰液或组织样品获得。与传统的癌症诊断方法相比，液体活检具有以下优势：1.易取得，液体活检样本可从尿液、唾液和胸腔积液中获得；2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性；3.能取样所有可能的癌细胞，而非仅局限于肿瘤活检的某部分；4.便于早期发现癌症；5.能用于监测肿瘤动态(治疗前、治疗间和治疗后)；6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。人类生物样本包含，源自所有组织(包括癌组织)的细胞、蛋白质、外来体和游离DNA(cfDNA)、游离RNA(cfRNA)。其中，游离DNA的浓度非常低，在血浆中约为1-10ng/mL。肿瘤突变DNA可以在来自癌症患者的生物样本的cfDNA中检测到，被称为循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，这些ctDNA多为大约134-144bp的DNA片段，其浓度小于cfDNA。由于ctDNA来自肿瘤细胞基因组突变，且其半衰期较短，当用于肿瘤示踪和筛查时，与蛋白类肿瘤标记物相比，ctDNA肿瘤标记物检测的假阳性率更低，准确率更高，因此ctDNA作为一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤生物标记物，适用于多种肿瘤的示踪和筛查。然而，目前临床上使用ctDNA辅助癌症诊断和治疗选择的主要挑战，在于如何开发高灵敏度的检测方法以便在高cfDNA背景水平中区分微弱的ctDNA信号，特别是对于ctDNA浓度可能至pg/mL水平的早期诊断，对检测方法的灵敏度和选择性要求更高。不仅如此，目前临床可用的检测试剂盒还普遍受到DNA提取方法不佳、亚硫酸氢盐处理量差、用于检测甲基化DNA的定量PCR方法设计不合理等诸多限制。Epigenomics公司生产的EpiproLung试剂盒，其检测针对肺癌的SHOX2和PTGER4的甲基化状态。然而，早期检测肺癌标记物的最佳方案来自HulbertA等人的2017年出版物(HulbertAet.al.2017)，该小组指出，SOX17、TAC1和CDO1的组合在预测早期患者的癌症方面表现最佳(IA-IIA期)，针对这三个基因的甲基化检测使得他们可以对肺癌早期检测达到93％和62％的特异性和敏感性。在上述资料的基础上，我们通过更加广泛和深入的研究，发现了可用于早期肺癌筛查的更好的甲基化基因靶标检测组合，并利用上述基因靶标检测组合制成了早期肺癌的检测和筛查试剂盒。
技术实现思路
为了进一步提高肺癌早期检测和筛查方法的特异性和敏感性，我们在反复实验的基础上，研制开发出了一种新的用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，试验证实，利用本专利技术检测试剂盒能够显著提高早期肺癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)。首先，本专利技术公开了一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，其通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断肺癌。本专利技术试剂盒中包含下述组成部分：(1)用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:1-2和探针SEQIDNO:3；(2)用于检测HOXA9基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:4-5和探针SEQIDNO:6；(3)用于检测TAC1基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:7-8和探针SEQIDNO:9；(4)用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:10-11和探针SEQIDNO:12。进一步地，上述特异性引物SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。进一步地，上述基于TaqManTM设计的探针SEQIDNO:3、6、9、12在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。进一步地，上述特异性引物SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11和基于TaqManTM设计的探针SEQIDNO:3、6、9、12的长度为10-50nt。具体的特异性引物和探针序列及硫代磷酸酯修饰位置如下表1所示：表1本专利技术试剂盒中包含的特异性引物和探针注：“*”表示DNA中的硫代磷酸酯修饰。进一步地，本专利技术试剂盒中还包含下述组成部分：(5)PCR反应缓冲液；(6)DNA聚合酶。进一步地，本专利技术试剂盒中还包含下述组成部分：(7)血浆游离DNA提取试剂；(8)血浆游离DNA甲基化转化试剂。优选地，上述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。本专利技术试剂盒的DNA甲基化检测系通过分析一个或多个特定基因检测区域的甲基化状态来对肺癌进行特异性检测与筛查。我们通过优化反应体系，使多个区域靶点的甲基化检测在一个反应中同时完成。其中对SHOX2、HOXA9和TAC1基因区域靶点的分析将用于肺癌检测，而对ACTB基因区域靶点的分析则用作内部对照以对DNA提取和亚硫酸氢盐转化是否成功进行检验。进一步地，所述DNA可以为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。进一步地，本专利技术试剂盒所检测的特定基因的检测靶点序列和检测靶点位置如下：(1)SHOX2基因：检测靶点序列如SEQIDNO:13所示，检测靶点位置为Chr3:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断肺癌，所述试剂盒中包含下述组成部分：(1)用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:1‑2和探针SEQ ID NO:3；(2)用于检测HOXA9基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:4‑5和探针SEQ ID NO:6；(3)用于检测TAC1基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:7‑8和探针SEQ ID NO:9；(4)用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:10‑11和探针SEQ ID NO:12。

【技术特征摘要】
1.一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断肺癌，所述试剂盒中包含下述组成部分：(1)用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:1-2和探针SEQIDNO:3；(2)用于检测HOXA9基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:4-5和探针SEQIDNO:6；(3)用于检测TAC1基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:7-8和探针SEQIDNO:9；(4)用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:10-11和探针SEQIDNO:12。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针SEQIDNO:3、6、9、12是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11和所述探针SEQIDNO:3、6、9、12的长度为10-50nt。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含下述组成部分：(5)PCR反应缓冲液；(6)DNA聚合酶。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含下述组成部分：(7)血浆游离DNA提取试剂；(8)血浆游离DNA甲基化转化试剂。7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。8.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。9.如权利要求1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒所检测的特定基因的检测靶点序列和检测靶点位置如下：(1)SHOX2基因：检测靶点序列如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩艳，霍华德，万季，王志强，余涛，张超，张剑，宋麒，
申请(专利权)人：深圳市新合生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44