一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物及结直肠癌早期诊断模型制造技术

本发明专利技术涉及临床分子诊断技术领域，具体公开一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物及结直肠癌早期诊断模型。本发明专利技术通过5‑hmC高通量测序技术，对结直肠癌患者与健康人外周血浆DNA全基因组5‑hmC表达量的检查，对比两组样本中全基因组基因位点5‑hmC表达差异，筛选表达差异最显著的部分基因位点作为该诊断模型的基因标志物，进而构建结直肠癌的早期诊断模型。经验证，本发明专利技术诊断的灵敏度、特异度均较高，与目前市场上的粪便隐血检测试剂盒、spetin9试剂盒相比，灵敏度和特异度分别提高约20％、8％。本发明专利技术的诊断方法具有检测无创、便捷等优点，可应用于临床一线，用于结直肠癌的早期筛查。

An Apparently Modified 5 hmC Multi-Molecular Marker and Early Diagnostic Model of Colorectal Cancer

The invention relates to the technical field of clinical molecular diagnosis, in particular to a 5 hmC multi-molecular marker based on apparent modification and an early diagnosis model of colorectal cancer. The present invention examines the whole genome 5 hmC expression of DNA in peripheral plasma of patients with colorectal cancer and healthy people by 5 hmC high-throughput sequencing technology, compares the difference of 5 hmC expression of whole genome gene locus in two groups of samples, and screens some gene loci with the most significant difference as gene markers of the diagnostic model, and then constructs an early diagnostic model of colorectal cancer. It has been proved that the sensitivity and specificity of the method are both high. Compared with the fecal occult blood detection kit and spetin 9 kit on the market, the sensitivity and specificity of the method are increased by about 20% and 8% respectively. The diagnostic method of the invention has the advantages of noninvasive detection, convenience and so on, and can be applied to the clinical front line for early screening of colorectal cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物及结直肠癌早期诊断模型
本专利技术涉及临床生物医学
，具体地说，是一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物及结直肠癌早期诊断模型。
技术介绍
结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是消化道常见的恶性肿瘤之一，全世界结直肠癌的发病率和死亡率处于恶性肿瘤的第三位。我国情况亦类似，结直肠癌是死亡率分别为男性第五位和女性第四位的恶性肿瘤。并且由于结直肠静脉回流的解剖学特点等原因，约有25％的患者在就诊同时即合并肝转移，使结直肠癌患者5年生存率明显下降。在结直肠癌早期阶段即确诊并接受治疗的患者5年生存率明显高于IV期患者。因此，在结直肠癌发展的早期阶段确诊在提高患者的长期生存中尤为关键。结直肠癌的筛查工作在早期诊断、提高患者长期生存中尤为重要。以往结直肠癌筛查方法包括结肠镜检查、软式乙状结肠镜检查(SIG)、计算机断层结肠成像(CTC)、基于愈创树脂的粪便隐血检测(gFOBT)、粪便免疫化学检测(FIT)、多靶点粪便DNA检测(sDNA)和血浆DNA中sept9甲基化检测(mSEPT9)。临床研究证实接受SIG筛查与无筛查的人群相比可明显降低结直肠癌发生率和死亡率，但获益更多局限于远端的结直肠癌，受试者的依从性为58％-83.5％并且有穿孔、出血等风险。CTC对直径大于等于10mm的新生物有相对较好的检出灵敏度和特意度，几项临床研究证实在肠道准备后的CTC检测中灵敏度为67％-100％，特异度为96％-98％；而在没有肠道准备的患者中灵敏度和特异度分别为67％-90％和85％-97％，但接受CTC检测的患者要接受辐射。在包括FIT和sDNA的粪便筛查试验表明，由于研究方式、人群的不同，检出的灵敏度、特异度波动范围较大，检出结果稳定性相对较差。美国的一项临床研究表明mSEPT9对结直肠癌患者的检出率灵敏度为48.2％和91.5％。虽然肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准，但由于本检测需要清理肠道、预约时间长、存在出血穿孔等风险，患者对于结肠镜的依从性偏低。而其他目前常用的筛查方法虽然经济、便捷，但存在灵敏度、特异度偏低、检测结果不稳定等诸多缺陷。使结直肠癌早期诊断困难重重，影响患者的早期检出率，致使结直肠癌患者生存率降低。结直肠癌的早期筛查工作亟待解决，迫切需要一种微创、灵敏、高效的早期筛查手段。现有的结直肠癌的筛查手段均具有其局限性，高效的诊断方法是研究的重点。随着肿瘤研究的进展，DNA表观修饰在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到关注。5-methylcytosine(5-mC)是DNA胞嘧啶环中第五碳通过脱氧核苷酸甲基转移酶甲基化所形成，在哺乳动物胚胎发育以及疾病发生发展中起着重要的作用。5-mC经过TET酶的氧化作用形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)。研究显示羟甲基化在正常基因组中表达量相对稳定，表明羟甲基化有独特的表观修饰作用，不仅仅是5-mC代谢的中间产物。5-hmC与包括癌症在内的多种疾病相关，在多种肿瘤组织中低水平的5-hmC得到证实。5-hmC水平的高低与肿瘤的类型及临床分期也有着密切的关系，如肺癌中，随着病理分期发展，5-hmC的水平进行性下降。然而，5-hmC在肠癌中的表达模式如何改变尚缺乏研究。肿瘤的液态活检因其无创、便捷等特点迅速发展，通过外周血的检测实现对肿瘤的诊断及预测成为研究热点。既往对cfDNA的研究中存在cfDNA含量低、检测困难等问题。上海易毕恩公司低输入量cfDNA的5hmC测序技术(Nano-hmC-Seal)，克服了以往DNA表观修饰检出率低的缺陷。然而微量5-hmC全基因组测序技术是否能实现结直肠癌患者早期诊断尚缺乏研究。因此本专利技术，针对结直肠癌患者早期诊断设计一种基于液态活检5-hmC修饰多标志物模型用于结直肠癌的早期诊断模型。中国专利文献201710662851.6公开了一种用于检测胰腺癌的基因标志物、试剂盒及胰腺癌检测方法，基因标志物包括一个或两个以上以下基因：麦芽糖酶、C型外源凝集素家族4成员C、分选蛋白7、间质同源框2、FAT非典型钙粘蛋白1、黄素包含单氧酶3、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白、磷脂磷酸酶相关蛋白3、α白蛋白和胶原蛋白V型α2链，通过高通量测序检测胰腺癌基因标志物中5-hmC的含量，从而判定胰腺癌是否存在。中国专利文献201710662852.0公开了用于检测肝肿瘤良恶性的基因标志物、试剂盒及检测方法，基因标志物包括一个或两个以上以下基因：FAT非典型钙粘蛋白1、雌激素相关受体γ、性别决定基因y染色体区域盒家族成员9、纤毛状络合物子单元1、1号染色体开放阅读框125抗体、络丝蛋白、转铁蛋白、TNF受体超家族成员、胰腺和十二指肠同圆框1、α-酸性糖蛋白2，通过高通量测序检测肝肿瘤基因标志物中5-hmC的含量，从而判定肝肿瘤良恶性。现有技术中，关于本专利技术基于表观修饰的5hmC多分子标志物及结直肠癌早期诊断模型，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术基于5-hmC修饰特征性变化检测的结直肠癌早期诊断模型是通过对外周血中游离DNA的5-hmC表观修饰进行检测，通过对比结直肠癌患者与健康人5-hmC修饰特征性变化差异性，建立早期诊断模型，可广泛用于结直肠癌患者的早期筛查、诊断等临床工作中。与现有传统结直肠癌早期筛查手段相比，本专利技术的检测方法仅需采集患者外周静脉血，采集过程与常规血液检查无明显差别，检测便捷、安全，无需患者肠道准备过程，可明显提高患者的依从性；此外，本方法尚有稳定性强、灵敏度和特异度高等优点，是一种较为理想的结直肠癌筛查手段。本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物结直肠癌早期诊断模型。本专利技术的第二个目的是，提供如上所述诊断模型在制备结直肠癌早期诊断试剂盒中的应用。本专利技术的第三个目的是，提供一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物结直肠癌早期诊断试剂盒。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物结直肠癌早期诊断模型，包括检测受试者外周血浆中基因标志物5-hmC表达量的试剂，所述基因标志物包括：GBX2FAM84AFAM25BLCE1FFBXL7DBX1KRTAP27-1AL353791.1CEBPDLTB4R2RP4-583P15.14OR5B2RPRMRNASE4INSL5AURKCIL36AAC017081.1SPA17NBPF12FABP1CST8。在上述基于表观修饰的5hmC多分子标志物结直肠癌早期诊断模型中，作为一个优选技术方案，所述模型中还包括正常人外周血样本。在上述基于表观修饰的5hmC多分子标志物结直肠癌早期诊断模型中，作为一个优选技术方案，所述模型中还包括记载有如下模型和评判方法的载体：Logistic回归模型通过评分值判定样本来源是否为结直肠患者，当评分值大于0.5，则该受试者患有结直肠癌，当评分值小于或等于0.5，则该受试者为正常；其中x1,x2,x3...xk分别为以上基因标志物5-hmC表达量标准化结果；b0为建模过程输出的常数项；b1,b2,b3...bk为对应基因标志物5-hmC表达量的系数，目前k＝22。为实现上述第二个目的，本专利技术采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物结直肠癌早期诊断模型，其特征在于，包括检测受试者外周血浆中基因标志物5‑hmC表达量的试剂，所述基因标志物包括：GBX2 FAM84A FAM25B LCE1F FBXL7 DBX1 KRTAP27‑1 AL353791.1 CEBPD LTB4R2 RP4‑583P15.14 OR5B2 RPRM RNASE4 INSL5 AURKC IL36A AC017081.1 SPA17 NBPF12 FABP1 CST8。

【技术特征摘要】
1.一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物结直肠癌早期诊断模型，其特征在于，包括检测受试者外周血浆中基因标志物5-hmC表达量的试剂，所述基因标志物包括：GBX2FAM84AFAM25BLCE1FFBXL7DBX1KRTAP27-1AL353791.1CEBPDLTB4R2RP4-583P15.14OR5B2RPRMRNASE4INSL5AURKCIL36AAC017081.1SPA17NBPF12FABP1CST8。2.根据权利要求1所述的诊断模型，其特征在于，还包括以下试剂：正常人外周血样本。3.根据权利要求1所述的诊断模型，其特征在于，还包括记载有如下模型和评判方法的载体：通过评分值判定样本来源是否为结直肠患者，当评分值大于0.5，则该受试者患有结直肠癌，当评分值小于或等于0.5，则该受试者为正常；其中x1,x2,x3...xk分别为以上有意义基因标志物5-hmC表达量标准化结果；b0为建模过程输出的常数项；b1,b2,b3...bk为对应基因标志物5-hmC表达量的系数，目前k＝22。4.权利要求1-3任一所述诊断模型在制备结直肠癌早期诊断试剂盒中的应用。5.一种基于表观修饰的5hmC多分子标志物结直肠癌早期诊断试剂盒，其特征在于，包括检测受试者外周血浆中基因标志物5-hmC表达量的试剂，所述基因标志物包括：GBX2FAM84AFAM25BLCE1FFBXL7DBX1KRTAP27-1AL353791.1CEBPDLTB4R2RP4-583P15.14OR5B2RPRMRNASE4INSL5AURKCIL36AAC017081.1SPA17NBPF12FABP1CST8。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括记载有如下模型和评判方法的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许剑民，常文举，刘天宇，韦烨，任黎，何国栋，吉美玲，朱德祥，陈竟文，冯青阳，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31