一种简易的斑点杂交加样方法技术

本发明专利技术公开了一种简易的斑点杂交加样方法，包括如下步骤：猪耳缘成纤维细胞的培养；细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整；添加样品：预热金属浴至85℃，并将硝酸纤维素膜裁剪至所需要的合适大小；通过美纹纸将硝酸纤维素膜固定于层板上；在硝酸纤维素膜上于85℃烘烤下进行加样；加样后用重物压住层板，以使硝酸纤维素膜和金属浴紧密接触；进行斑点杂交；分析结果，比较灰度值。本发明专利技术整合利用了实验室里现有的资源，仅仅利用了盛装白枪头的层板和恒温金属浴，节省了很多耗材，而且省下了安装多管吸印仪耗费的时间和人力，还对加样操作进行了简化，对于技术优化具有重大意义。

A Simple Dot Hybridization Sampling Method

The invention discloses a simple spot hybridization sampling method, which comprises the following steps: culture of pig ear edge fibroblasts; extraction of cell RNA, determination and adjustment of concentration; adding sample: preheating metal bath to 85 degree C, and cutting the nitrocellulose membrane to the right size; and holding the nitrocellulose film on the laminates through the beautiful paper, and the nitrocellulose membrane. Sampling was carried out at 85 C; after sample addition, the laminates were pressed with heavy objects to make the cellulose nitrate film and metal bath contact closely; dot hybridization was carried out; the analysis results were compared with gray values. The invention integrates and utilizes the existing resources in the laboratory, only uses the layer board with white gun head and the constant temperature metal bath, saves a lot of consumables, saves the time and manpower for installing the multi-tube printer, and simplifies the sampling operation, which is of great significance for technical optimization.

【技术实现步骤摘要】
一种简易的斑点杂交加样方法
本专利技术属于细胞生物学领域，具体是一种简易的斑点杂交加样方法。
技术介绍
斑点杂交(DotBlot)是一种检测、分析和鉴定DNA、RNA和蛋白质的技术。将待测样品滴加到硝酸纤维素膜(或尼龙膜、NC膜)上，然后通过烘烤或紫外线照射的方法来固定样品，接下来用已标记的探针进行杂交，然后洗膜(除去未接合的探针)，最后放射自显影，通过显影斑点的有无及颜色的深浅来判断是否有杂交及其杂交强度。本方法耗时短，可做半定量分析，并且效率高，一张膜上可以同时点上多个样品，对其相关特征进行检测。在斑点杂交的操作流程中，加样这一步是至关重要的，如果加样时操作不佳，可能会使得样品在膜上扩散，这样不但使显影后的区域呈现出非斑点状，影响实验结果的美观，还会因为样品的分散，对灰度的分析带来麻烦，甚至影响到结果分析的准确性。更有甚者，样品的扩散会导致样品孔之间交叉污染，直接导致实验结果的不准确或实验失败。因此，利用斑点杂交进行相关样品的检测时，势必要在加样这一步下功夫，加样的优劣很大程度上影响着整个实验。为了使加样时避免出现上述情况，现在市售有多种多管吸印仪(Manifold)，如MinifoldⅠ和Ⅱ、SmartBlotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，且膜下和膜上会形成很大的负压，这样的话样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，不会出现样品扩散，从而影响结果的美观性，甚至准确性的情况。这样的确保证了印迹的高品质，也正是因为如此，许多专利技术、科研所或者其他可以进行斑点杂交的工作人员在实践时，都会使用多管吸印仪来确保加样这一步骤的质量，从而确保整个实验的质量。但是，购买多管吸印仪需要花费一定的费用，而且其安装和操作也较为繁琐，无形之中耽误了实验者的时间，也给操作立起了一道门槛，给实验新手的入门带来一定的困难。因此，如果能够利用专利技术的现有资源，创造出一种在不影响实验效果前提下的更简单易行的斑点杂交加样方法，会大大地简化实验操作，使得斑点杂交易于上手，可以大量地进行，并且能够节省时间，从而提高科研效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简易的斑点杂交加样方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种简易的斑点杂交加样方法，包括如下步骤：(1)猪耳缘成纤维细胞的培养；(2)细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整；(3)添加样品：预热金属浴至85℃，并将硝酸纤维素膜裁剪至所需要的合适大小；通过美纹纸将硝酸纤维素膜固定于层板上；在硝酸纤维素膜上于85℃烘烤下进行加样；加样后用重物压住层板，以使硝酸纤维素膜和金属浴紧密接触；(4)进行斑点杂交；(5)分析结果，比较灰度值。优选地，步骤(1)中，猪耳缘成纤维细胞培养的具体步骤如下:①解冻两管冻存于液氮中的猪耳缘成纤维细胞于两个直径9cm的培养皿中，在温度为37℃，CO2体积分数为5％的平衡箱中培养；②培养一定时间后，在显微镜下观察，待贴壁的细胞面积达到皿底面积的95％时，对照组更换新的培养基，试验组更换含有浓度为20mM的环亮氨酸的培养基，继续在平衡箱中培养48h。优选地，步骤(2)中，细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整的具体步骤如下：①在显微镜下观察对照组和试验组的细胞是否生长良好，若细胞表现为贴壁，且面积达到皿底面积的95％，则进行RNA的提取；RNA的提取分三组，分别是：293T-作为阳性对照，作用是用于检测样品是否附着于硝酸纤维素膜上，以及成像是否正常等；对照组-用作空白对照的猪耳缘成纤维细胞；试验组-添加环亮氨酸处理48h之后的猪耳缘成纤维细胞；②先提取RNA，对三组RNA的浓度进行测定，再调整RNA浓度，使得三组RNA的浓度一致；③提取293T细胞的RNA具体过程如下，其他两组RNA提取方法与之相同：a.预处理：将无RNA酶的枪头放入超净台中紫外照射30min，打开金属浴55℃，预热DEPC水；b.将293T细胞的培养液PAF弃掉，然后用PBS清洗两遍，弃掉PBS后加入1mL的Trizol裂解细胞；c.将装有RNA样品的1.5mL离心管放在涡旋震荡仪上震荡30s-60s，随后置于冰上静止2min；d.将裂解后的细胞-Trizol混合物移入1.5mL离心管中，再加入400μL的氯仿，迅速混匀，震荡2min，然后迅速插在冰上静止，随后在4℃下，转速13000rpm离心10min，离心后，将该离心管静置于冰上，用吸取上层水相清液，将清液置于另一1.5mL离心管中，并放于冰上；e.向上步装有清液的离心管中加入40μL异丙醇，充分混匀后置于-80℃冰箱30min后取出，在4℃下，转速12000rpm离心15min；f.弃掉上步的上层清液，留下底部白色沉淀，加入体积分数为75％的RNAsefree乙醇800μL洗涤沉淀，4℃下，转速12000rpm离心10min；g.重复上述步骤一次；h.将离心管在4℃下转速为12,000rpm离心2min，将剩余的75％RNAsefree乙醇吸走，留下沉淀，再静置2min以确保乙醇完全挥发；i.取31μL加热至55℃的DEPC水于上步的RNA沉淀中，用移液器吹打混匀至沉淀完全溶解后，吸取1μL于分光光度计中，测量浓度并记录相关数值；j.将所有组的RNA样品的浓度调一致，用于斑点杂交。4.根据权利要求1所述的简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，步骤(4)中，斑点杂交的具体步骤如下：①RNA变性：使三组RNA样品在95℃下变性10min，以破坏其二三级结构，然后迅速置于冰上冷却2min，使其结构稳定在一级结构；②在进行步骤①的同时将硝酸纤维素膜于金属浴85℃中预热，待步骤①的RNA样品处理好之后用无RNA酶的枪头进行梯度加样，第一排点1μL，第二排点2μL，然后85℃烘烤6h；③将梯度加样后的三组RNA样品于水平摇床中用质量分数为5％的BSA常温封闭2h；④加m6A一抗于5％BSA中，按1:5000的体积比进行稀释，置于4℃摇床上12h以上；⑤次日早晨，常温下在水平摇床中用1XPBST洗一抗，6次，6min/次；⑥将二抗以3:10000的体积比进行稀释于水中,再将该稀释后的二抗与质量分数为5％的牛奶混合，水平摇床，常温，105min；⑦常温下在水平摇床中用1XPBST洗二抗，5次，5min/次；⑧配制显影液，将NcmECLUltraEnhancerReagent(A)和NcmECLUltraStabilizedperoxideReagent(B)按体积比例1:1混合；⑨进行放射自显影。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术对斑点杂交的加样过程进行了简化，并且通过具体的实验重复验证了结果的准确性和可靠性，从而说明该加样方法不但简单易行，节约时间和金钱成本，而且得出的实验结果是可信的，因此具备了在今后的斑点杂交技术中可以应用的条件。该方法整合利用了专利技术里现有的资源，仅仅利用了盛装白枪头的层板和恒温金属浴，节省了很多耗材，而且省下了安装多管吸印仪耗费的时间和人力，还对加样操作进行了简化，对于技术优化具有重大意义。附图说明图1为使用本专利技术的加样方法所得到的三组斑点杂交结果图。图2为对三组结果里对照组和试验组的灰度值进行分析，并进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)猪耳缘成纤维细胞的培养；(2)细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整；(3)添加样品：预热金属浴至85℃，并将硝酸纤维素膜裁剪至所需要的合适大小；通过美纹纸将硝酸纤维素膜固定于层板上；在硝酸纤维素膜上于85℃烘烤下进行加样；加样后用重物压住层板，以使硝酸纤维素膜和金属浴紧密接触；(4)进行斑点杂交；(5)分析结果，比较灰度值。

【技术特征摘要】
1.一种简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)猪耳缘成纤维细胞的培养；(2)细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整；(3)添加样品：预热金属浴至85℃，并将硝酸纤维素膜裁剪至所需要的合适大小；通过美纹纸将硝酸纤维素膜固定于层板上；在硝酸纤维素膜上于85℃烘烤下进行加样；加样后用重物压住层板，以使硝酸纤维素膜和金属浴紧密接触；(4)进行斑点杂交；(5)分析结果，比较灰度值。2.根据权利要求1所述的简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，步骤(1)中，猪耳缘成纤维细胞培养的具体步骤如下:①解冻两管冻存于液氮中的猪耳缘成纤维细胞于两个直径9cm的培养皿中，在温度为37℃，CO2体积分数为5％的平衡箱中培养；②培养一定时间后，在显微镜下观察，待贴壁的细胞面积达到皿底面积的95％时，对照组更换新的培养基，试验组更换含有浓度为20mM的环亮氨酸的培养基，继续在平衡箱中培养48h。3.根据权利要求1所述的简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，步骤(2)中，细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整的具体步骤如下：①在显微镜下观察对照组和试验组的细胞是否生长良好，若细胞表现为贴壁，且面积达到皿底面积的95％，则进行RNA的提取；RNA的提取分三组，分别是：293T-作为阳性对照，作用是用于检测样品是否附着于硝酸纤维素膜上，以及成像是否正常等；对照组-用作空白对照的猪耳缘成纤维细胞；试验组-添加环亮氨酸处理48h之后的猪耳缘成纤维细胞；②先提取RNA，对三组RNA的浓度进行测定，再调整RNA浓度，使得三组RNA的浓度一致；③提取293T细胞的RNA具体过程如下，其他两组RNA提取方法与之相同：a.预处理：将无RNA酶的枪头放入超净台中紫外照射30min，打开金属浴55℃，预热DEPC水；b.将293T细胞的培养液PAF弃掉，然后用PBS清洗两遍，弃掉PBS后加入1mL的Trizol裂解细胞；c.将装有RNA样品的1.5mL离心管放在涡旋震荡仪上震荡30s-60s，随后置于冰上静止2min；d.将裂解后的细胞-Trizol混合物移入1.5mL离心管中，再加入400μL的氯仿，迅速混匀，震荡2min，然后迅速插...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹祖兵，王怡青，童旭，张丹丹，宁伟，齐昕，许腾腾，高迪，张运海，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34