外周血白细胞SNP位点快速检测方法技术

一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法，其特征在于采用氯化铵溶液、纳米孔球、六寡聚核苷酸作为检测使用的用品，经过如下几个步骤完成外周血白细胞SNP位点的检测，第一步，采取患者EDTA抗凝血样本；第二步，分离并富集白细胞；第三步，富集到的白细胞切割分段；第四步，将分段后白细胞双链DNA解链，生成单链DNA，用DNA的碱基互补原则，使单链DNA与荧光标记的六寡聚核苷酸结合生成杂交片段：第五步，杂交的片段进入纳米孔球，使用荧光检测仪进行检测，建立一组完整的基因荧光标记图，利用计算机进行计算，最终所需的SNP位点基因组序列。本发明专利技术不需要专业的实验室、不需要PCR上岗证、检测成本低、过程简单、时间短、结果准确。

【技术实现步骤摘要】
外周血白细胞SNP位点快速检测方法
本专利技术涉及生物检测
，特别是一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法。
技术介绍
SNP，英文全称是singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异基因中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。由于人体大量存在的SNP位点，每个人SNP的位点差异形成了不同的基因型，决定了人们患有疾病的不同风险和对药物的不同反应，并使人们有机会发现各种疾病，其中还包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP位点发现疾病相关基因突变非常实用，因此实验室条件下SNP的位点检测有巨大临床需求。目前公知的技术中，实验室情况下SNP位点检测主要包括以下几种方法。第一种：一、二代基因测序下的PCR扩增检测法，这种方法需要在专业的PCR实验室内才能操作，实验室存在建设成本高导致检测成本增加的缺点；由于所需知识面要求高、操作人员必须经过专业陪训才能操作（操作人员需要持有PCR上岗证）；检测中程序多操作繁琐，检测时间较长，最多72小时才能完成所有检测流程；在进行检测中还不可避免会受到污染导致其检测结果受到影响。第二种：荧光PCR扩增检测法：这种方法需要在专业的PCR实验室内才能操作，实验室存在建设成本高导致检测成本增加的缺点；由于所需知识面要求高、操作人员必须经过专业陪训才能操作（操作人员需要持有PCR上岗证）；检测中程序多操作繁琐，检测时间较长，一般需要24小时才能完成所有检测流程，在进行检测中还不可避免会受到污染导致其检测结果受到影响。第三种：基因芯片下的杂交显色检测法：这种方法需要在专业的PCR实验室内才能操作，实验室存在建设成本高导致检测成本增加的缺点；由于所需知识面要求高、操作人员必须经过专业陪训才能操作（操作人员需要持有PCR上岗证）；检测中程序多操作繁琐，检测时间较长，一般需要8至24小时才能完成所有检测流程；在进行检测中还不可避免会受到污染导致其检测结果受到影响，检测的结果假阳性高，检测的结果不准确。上述几种检测方法对SNP位点的检测造成了制约。
技术实现思路
为了克服现有多种检测方法对SNP位点检测造成了制约的弊端，本专利技术提供了一种不需要专业的实验室、检测人员不需要PCR上岗证、检测成本低、检测过程简单、检测时间短、检测结果准确的一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法，其特征在于采用氯化铵溶液、纳米孔球、六寡聚核苷酸作为检测使用的用品，经过如下几个步骤完成外周血白细胞SNP位点的检测，第一步，采取患者EDTA抗凝血样本；第二步，分离并富集白细胞；第三步，富集到的白细胞切割分段；第四步，将分段后白细胞双链DNA解链，生成单链DNA，用DNA的碱基互补原则，使单链DNA与荧光标记的六寡聚核苷酸结合生成杂交片段：第五步，杂交的片段进入纳米孔球，使用荧光检测仪进行检测，建立一组完整的基因荧光标记图，利用计算机进行计算，最终所需的SNP位点基因组序列。所述氯化铵溶液、纳米孔球、六寡聚核苷酸组分的组成比例分别是：氯化铵溶液0.74%，纳米孔球0.3%，六寡聚核苷酸10UM。所述采取患者的DTA抗凝血样本，样本量是2ml。所述分离并富集白细胞过程如下，把氯化铵溶液和2ml患者的DTA抗凝血样本放入试管内充分混匀，室温静置10分钟后，用转速每分钟13000转的离心机离心10分钟，并去除上清液，下层即为所需白细胞。所述进行将富集到的白细胞切割分段工序时，采用在白细胞内加入限制性核酸内切酶，催化白细胞基因组内多核苷酸的链断裂，将白细胞基因组随机切割为250bp左右的双链DNA片段。所述进行将分段后白细胞双链DNA解链，生成单链DNA，用DNA的碱基互补原则，使单链DNA与荧光标记的六寡聚核苷酸结合生成杂交片段工序时，通过荧光检测仪的温控系统，把双链DNA解链并生成单链DNA。本专利技术有益效果是：本专利技术SNP位点检测工序不需要专门的实验室、检测成本低；检测人员不需要持有PCR上岗证、只需要具有一定相关知识即可操作，使用更加方便；所需检测使用的用品少，操作流程简单，克服了现有检测方法繁琐的缺点；过程中不容易被污染、得到的结果更加准确；操作时间短，一般一小时即可完成所有工序操作并得到最终检测结果；克服了现有检测方法时间长的缺点。本专利技术能为通过SNP位点检测发现疾病相关基因突变提供有力技术支撑，基于上述，所以本专利技术具有好的应用前景。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明。附图1是本专利技术的检测流程框图。具体实施方式图1中所示，一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法，采用氯化铵溶液、纳米孔球、六寡聚核苷酸作为检测使用的用品，氯化铵溶液、纳米孔球、六寡聚核苷酸组分的组成比例分别是：氯化铵溶液0.74%，纳米孔球0.3%，六寡聚核苷酸10UM。图1中所示，一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法，经过如下几个步骤完成外周血白细胞SNP位点的检测，第一步，采取患者EDTA抗凝血样本；患者的DTA抗凝血样本量是2ml。第二步，分离并富集白细胞；分离并富集白细胞过程如下，把氯化铵溶液和2ml的患者的DTA抗凝血样本放入试管内充分混匀，室温静置10分钟后，用转速每分钟13000转的离心机离心10分钟，并去除上清液，下层即为所需白细胞。第三步，富集到的白细胞切割分段；采用在白细胞内加入限制性核酸内切酶，催化白细胞基因组内多核苷酸的链断裂，将白细胞基因组随机切割为250bp左右的双链DNA片段。第四步，将分段后白细胞双链DNA解链，生成单链DNA，用DNA的碱基互补原则，使单链DNA与荧光标记的六寡聚核苷酸结合生成杂交片段：通过荧光检测仪的温控系统，把双链DNA解链并生成单链DNA。第五步，杂交的片段进入纳米孔球（在现有基因检测技术中应用较多），使用荧光检测仪进行检测，建立一组完整的基因荧光标记图，利用计算机计算，最终所需的SNP位点基因组序列。本专利技术SNP位点检测工序不需要专门的实验室、检测成本低；检测人员不需要PCR上岗证、只需要具有一定相关知识即可操作，使用更加方便；所需检测使用的用品少，操作流程简单，克服了现有检测方法繁琐的缺点；过程中不容易被污染得到的结果更加准确；操作时间短，一般一小时即可完成所有工序操作并得到最终检测结果；克服了现有检测方法时间长的缺点。本专利技术不需要专业的实验室、检测人员不需要PCR上岗证、检测成本低、检测过程简单、检测时间短、检测结果准确，能为通过SNP发现疾病相关基因突变提供有力技术支撑，基于上述，所以本专利技术具有好的应用前景。以上显示和描述了本专利技术的基本原理和主要特征及本专利技术的优点，对于本领域技术人员而言，显然本专利技术不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本专利技术的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本专利技术。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本专利技术的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法，其特征在于采用氯化铵溶液、纳米孔球、六寡聚核苷酸作为检测使用的用品，经过如下几个步骤完成外周血白细胞SNP位点的检测，第一步，采取患者EDTA抗凝血样本；第二步，分离并富集白细胞； 第三步，富集到的白细胞切割分段；第四步，将分段后白细胞双链DNA解链，生成单链DNA，用DNA的碱基互补原则，使单链DNA与荧光标记的六寡聚核苷酸结合生成杂交片段：第五步，杂交的片段进入纳米孔球，使用荧光检测仪进行检测，建立一组完整的基因荧光标记图，利用计算机进行计算，最终所需的SNP位点基因组序列。

【技术特征摘要】
1.一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法，其特征在于采用氯化铵溶液、纳米孔球、六寡聚核苷酸作为检测使用的用品，经过如下几个步骤完成外周血白细胞SNP位点的检测，第一步，采取患者EDTA抗凝血样本；第二步，分离并富集白细胞；第三步，富集到的白细胞切割分段；第四步，将分段后白细胞双链DNA解链，生成单链DNA，用DNA的碱基互补原则，使单链DNA与荧光标记的六寡聚核苷酸结合生成杂交片段：第五步，杂交的片段进入纳米孔球，使用荧光检测仪进行检测，建立一组完整的基因荧光标记图，利用计算机进行计算，最终所需的SNP位点基因组序列。2.根据权利要求1所述的一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法，其特征在于所述氯化铵溶液、纳米孔球、六寡聚核苷酸组分的组成比例分别是：氯化铵溶液0.74%，纳米孔球0.3%，六寡聚核苷酸10UM。3.根据权利要求1所述的一种外周血白细胞SNP位点快速检测方法，其特征在于采取患者...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔铮，
申请(专利权)人：济南广音医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37