基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用，属于分子生物技术领域，试剂盒包括裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍5～8mol/L、糖原60～100mg/L、Tris‑Cl 10～30mmol/L、EDTA 1～3mol/L、Triton X‑100 0.2％～0.5％(v/v)和异丙醇30％～40％(v/v)，裂解液结合液的溶剂为无菌水。本发明专利技术试剂盒的中裂解结合液将裂解液与结合液合二为一，大大地增强提取效率；另外，本发明专利技术试剂盒中试剂预分装在孔板内，实现核酸自动化的磁珠法提取。

A Kit for Nucleic Acid Extraction Based on Magnetic Bead Method and Its Application

The invention discloses a kit for nucleic acid extraction based on magnetic bead method and its application, which belongs to the field of molecular biotechnology. The kit includes pyrolysis binding solution, buffer solution, detergent I, detergent II and eluent. The pyrolysis binding solution contains the following concentration components: guanidine isothiocyanate 5-8 mol/L, glycogen 60-100 mg/L, Tris Cl 10-30 mmol/L, EDTA 1-3 mol/L, Triton X 10. 0.2%-0.5%(v/v) and isopropanol 30%-40%(v/v), and the solvent of pyrolysis solution conjugate is sterile water. In addition, the reagent in the kit is pre-packed in the orifice plate to realize the automated magnetic bead extraction of nucleic acid.

【技术实现步骤摘要】
基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用
本专利技术属于分子生物
，尤其涉及基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用。
技术介绍
核酸提取的技术主要有酚-氯仿抽提法、碱抽提法和磁珠法，磁珠法中有使用96深孔板搭配Smart32核酸自动提取仪进行提取。然而这些方法均存在一些不足，如酚-氯仿抽提法能够获得较好质量的核酸，其用到的化学物质(如：氯仿、苯酚等)的毒性不可忽略，对操作人员的安全有很大威胁，而且整个提取过程耗时长。另外，现有技术没有完全实现自动化，多数是半自动化的，这给操作人员带来极大的不便。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术存在的不足，而提供基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用，本专利技术试剂盒的中裂解结合液将裂解液与结合液合二为一，大大地增强提取效率；另外，本专利技术试剂盒中试剂预分装在孔板内，实现核酸自动化的磁珠法提取。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒，其包括裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍5～8mol/L、糖原60～100mg/L、Tris-Cl10～30mmol/L、EDTA1～3mol/L、TritonX-1000.2％～0.5％(v/v)和异丙醇30％～40％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水。异硫氰酸胍作为蛋白变性剂，通过变性蛋白从而裂解细胞。糖原可作为核酸助沉剂。Tris-Cl溶液在裂解过程中使DNA保持稳定的二级结构。EDTA是一种能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合的螯合剂，其作为核酸酶抑制剂。TritonX-100是一种非离子型表面活性剂，其能够溶解细胞内的脂质，增加细胞膜的通透性，有助于核酸的释放。本专利技术裂解结合液将裂解液与结合液合二为一，既能裂解细胞，又能为核酸与磁珠的结合提供合适的环境，减少了操作步骤和提高核酸提取的质量。作为上述技术方案的改进，试剂盒还包含消化液，所述消化液包含以下浓度的组分：Nacl10～20mmol/L和SDS0.01％～0.05％(w/v)，所述消化液的溶剂为无菌水。在处理干血片、口拭子等复杂样本时，需要对样本进行初步消化，有助于更好的裂解。其中，NaCl提供了一个高盐环境，有助于蛋白质变性；SDS是常用的离子型表面活性剂，可使细胞膜裂解，通过与膜蛋白疏水部分结合并使其与膜分离，高浓度的SDS还可以破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，从而改变蛋白质的构象。作为上述技术方案的改进，所述缓冲液包含浓度为0.1％～1％(v/v)的TritonX-100，所述缓冲液的溶剂为无菌水；缓冲液有助于磁珠与磁棒更好的结合。作为上述技术方案的改进，所述洗涤液Ⅰ包含以下浓度的组分：高氯酸钠0.5～2mol/L和乙醇40％～60％(v/v)，所述洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；所述洗涤液Ⅱ包含浓度为40％～60％(v/v)的乙醇，所述洗涤液Ⅱ的溶剂为无菌水。洗涤液Ⅰ可以洗去沾在核酸表面的蛋白质，其中高氯酸钠为强氧化剂，也是高离液盐，能有效洗去蛋白质。洗涤液Ⅱ洗去沾在核酸表面的盐离子。作为上述技术方案的改进，所述洗脱液包含浓度为10～30mmol/L且pH为8的Tris-Cl，所述洗脱液的溶剂为无菌水。洗脱液可以溶解核酸，稳定保存DNA和RNA。作为上述技术方案的改进，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍6mol/L、糖原80mg/L、Tris-Cl20mmol/L、EDTA2mol/L、TritonX-1000.5％(v/v)和异丙醇35％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水；所述消化液包含以下浓度的组分：Nacl10mmol/L和SDS0.03％(w/v)，所述消化液的溶剂为无菌水；所述缓冲液包含浓度为0.2％(v/v)的TritonX-100，所述缓冲液的溶剂为无菌水；所述洗涤液Ⅰ包含以下浓度的组分：高氯酸钠2mol/L和乙醇50％(v/v)，所述洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；所述洗涤液Ⅱ包含浓度为50％(v/v)的乙醇，所述洗涤液Ⅱ的溶剂为无菌水；所述洗脱液包含浓度为20mmol/L且pH为8的Tris-Cl，所述洗脱液的溶剂为无菌水。作为上述技术方案的进一步改进，所述裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液预分装在孔板中，试剂预分装后孔板进行分膜处理。作为上述技术方案的更进一步改进，所述试剂盒采用预分装孔板模式，所述孔板为96孔，第1列和第7列预分装的是裂解结合液，第2列和第8列预分装的是磁珠和缓冲液，第3列和第9列预分装的是洗涤液Ⅰ，第4、5列和10、11列预分装的是洗涤液Ⅱ，第6列和第12列预分装的是洗脱液。作为上述技术方案的更进一步改进，预分装的裂解结合液的体积为200μl，预分装的磁珠液的体积为20μl，预分装的缓冲液的体积为200μl，预分装的洗涤液Ⅰ的体积为500μl，预分装的洗涤液Ⅱ的体积为500μl，预分装的洗脱液的体积为100μl。作为上述技术方案的更进一步改进，当样本为液体时，裂解结合液中加入20μl蛋白酶K和200μl样本；当样本为非液体时，将样本剪成碎块，并加入2ml消化液和200μl蛋白酶K，消化结束后即得混合液，向裂解结合液中加入200μl混合液；所述蛋白酶K的浓度为20mg/ml。另外，本专利技术还提供预分装孔板模式的试剂盒在核酸自动提取仪smart32或S48的程序，仅列出96孔板中1～6列孔：1)第1列孔内通过裂解结合液，先释放核酸；2)磁棒转到第2列孔内，在缓冲液的作用下吸附磁珠；3)带有磁珠的磁棒转到第1列孔内，磁珠与核酸结合；4)带有核酸的磁棒转到第3列孔内，在洗涤液Ⅰ的作用下洗去核酸上的蛋白质；5)带有核酸的磁棒转到第4列孔内，在洗涤液Ⅱ的作用下洗去核酸上多余的糖类、盐类等杂质；6)带有核酸的磁棒转到第5列孔内，继续在洗涤液Ⅱ的作用下洗去核酸上面多余的糖类、盐类等杂质；7)带有核酸的磁棒转到第6列孔，在55℃干燥4分钟，使残余的乙醇挥干；然后在洗脱液的作用下，使核酸从磁珠上分离下来，从而达到洗脱的目的；8)带有磁珠的磁棒转到第4列孔，将磁珠弃下，实验结束。另外，本专利技术还提供液体样本的核酸提取方法，所示液体样本为全血、血清、血浆或唾液，其包括以下步骤：1)将预分装深孔板颠倒混匀后瞬时离心10s，小心撕开封膜，并在第1列孔中加入200μl的待测样本和20微升蛋白酶K；2)在核酸提取仪上设置提取程序，然后进行核酸的全自动提取；3)提取程序运行完成后，取出预分装深孔板，其中第6列孔的溶液即为核酸溶液。另外，本专利技术还提供非液体样本的核酸提取方法，所示非液体样本为干血片，其包括以下步骤：1)用剪刀将非液体样本剪成碎片；2)在5ml离心管中加入碎片、2ml消化液和200μl蛋白酶K；3)振荡混匀，高速离心10s，56℃温育30min，其间不时颠倒180度振荡，消化结束后即得混合液；4)将预分装深孔板颠倒混匀后瞬时离心10s，小心撕开封膜，并在第1列孔中加入200μl混合液；5)在核酸提取仪上设置提取程序，然后进行核酸的全自动提取；6)提取程序运行完成后，取出预分装深孔板，其中第6列孔的溶液即为核酸溶液。本专利技术有益效果：本专利技术提供基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用，本专利技术试剂盒具有以下优点：1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍5～8mol/L、糖原60～100mg/L、Tris‑Cl 10～30mmol/L、EDTA 1～3mol/L、Triton X‑100 0.2％～0.5％(v/v)和异丙醇30％～40％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水。

【技术特征摘要】
1.基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液、缓冲液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗脱液，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍5～8mol/L、糖原60～100mg/L、Tris-Cl10～30mmol/L、EDTA1～3mol/L、TritonX-1000.2％～0.5％(v/v)和异丙醇30％～40％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含消化液，所述消化液包含以下浓度的组分：Nacl10～20mmol/L和SDS0.01％～0.05％(w/v)，所述消化液的溶剂为无菌水。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包含浓度为0.1％～1％(v/v)的TritonX-100，所述缓冲液的溶剂为无菌水。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液Ⅰ包含以下浓度的组分：高氯酸钠0.5～2mol/L和乙醇40％～60％(v/v)，所述洗涤液Ⅰ的溶剂为无菌水；所述洗涤液Ⅱ包含浓度为40％～60％(v/v)的乙醇，所述洗涤液Ⅱ的溶剂为无菌水。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包含浓度为10～30mmol/L且pH为8的Tris-Cl，所述洗脱液的溶剂为无菌水。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液包含以下浓度的组分：异硫氰酸胍6mol/L、糖原80mg/L、Tris-Cl20mmol/L、EDTA2mol/L、TritonX-1000.5％(v/v)和异丙醇35％(v/v)，所述裂解液结合液的溶剂为无菌水；所述消化液包含以下浓度的组分：Nacl10mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋卉，迟海洋，方春生，王笑丹，余永红，
申请(专利权)人：广东食品药品职业学院，
类型：发明
国别省市：广东,44