一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高产L‑色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。本发明专利技术是以大肠杆菌CICC 10303作为出发菌株，采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术，替换莽草酸激酶编码基因aroK启动子为强启动子T7；替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为弱启动子tac；敲除色氨酸转运体编码基因mtr，阻止发酵过程色氨酸转运回胞内。最终得到积累L‑色氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到36g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L‑色氨酸奠定了基础。

A Recombinant Escherichia coli with High L-tryptophan Production and Its Construction Method

The invention discloses a recombinant Escherichia coli with high L_tryptophan production and a construction method thereof, which belongs to the field of genetic engineering technology. The present invention is based on Escherichia coli CICC 10303 as the starting strain, using CRISPR_Cas9 gene editing technology, replacing shikimic acid kinase coding gene aroK promoter as strong promoter T7, replacing pheA promoter as weak promoter tac, and knocking out tryptophan transporter coding gene MTR to prevent tryptophan transporting back into cells during fermentation. Finally, the L-tryptophan-accumulating E. coli genetic engineering bacteria were obtained, the yield reached 36 g/L, which laid a foundation for further metabolic engineering transformation of E. coli to produce L-tryptophan.

【技术实现步骤摘要】
一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法
本专利技术涉及一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程

技术介绍
L-色氨酸作为一种非常重要的芳香性氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。在生物体内，L-色氨酸可以合成5-羟基色胺、烟酸、色素、生物碱、辅酶、吲哚乙酸等重要的生物活性物质，对人和动物的生长发育起重要作用，广泛应用于食品、医药、饲料等方面。L-色氨酸的生产最早主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂等缺点，因而逐渐被淘汰。由于成本低廉、原料来源广泛、环境污染小等特点，微生物法生产L-色氨酸已经得到了广泛的应用。目前，微生物法生产L-色氨酸存在产量不高、操作复杂等缺点。2001年，王健等用硫酸二乙酯(DES)作为诱变剂，选取了一株酪氨酸、苯丙氨酸双营养缺陷株出发菌株，经过多次诱变处理之后，选育出一株L-色氨酸生产菌株，分批连续发酵64h后，L-色氨酸积累量可以达到7.28g/L。2007年，陈俊峰等利用多次诱变的分离方法，以一株谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，得到一株苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型的L.色氨酸结构类似物抗性突变株，摇瓶发酵96h后，L-色氨酸积累量达到10.82g/L。大肠杆菌(Escherichiacoli)已经被应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-色氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在大肠杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对大肠杆菌进行遗传改造的方法，对于氨基酸生产领域有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种产L-色氨酸的重组大肠杆菌，替换了莽草酸激酶基因aroK启动子为T7启动子、敲除了色氨酸转运体编码基因mtr和替换了预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子。在本专利技术的一种实施方式中，所述的tac启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，莽草酸激酶aroK基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，色氨酸转运体编码基因mtr的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，预苯酸脱氢酶编码基因pheA的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，是对大肠杆菌CICC10303进行基因组编辑得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。本专利技术的第二个目的是提供上述的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：1)构建T7启动子替换重组片段、tac启动子替换重组片段以及敲除mtr基因重组片段：将大肠杆菌莽草酸激酶编码基因aroK基因簇起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T7AROK；将预苯酸脱氢酶编码基因pheA的起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入启动子tac，得到片段TACPHE；将色氨酸转运体编码基因mtr上下游同源臂融合，得到片段MTRD。2)构建重组质粒：将片段T7AROK、TACPHE、MTRD分别与含有sgRNA的线性化载体PCR连接，分别得到重组质粒含T7AROK的重组质粒、含TACPHE的重组质粒、含MTRD的重组质粒；3)构建重组大肠杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC10303，得到大肠杆菌CICC10303-cas9；随后将含T7AROK的重组质粒转化大肠杆菌CICC10303-cas9，得到重组大肠杆菌CICC10303-aroKT；将含TACPHE的重组质粒转化大肠杆菌CICC10303-aroKT，得到重组大肠杆菌CICC10303-pheAT；将含MTRD的重组质粒转化大肠杆菌CICC10303-pheAT，得到重组大肠杆菌CICC10303-mtrD；去除外源质粒后，得到重组大肠杆菌CICC10303-TRYP，所述外源质粒包括含T7AROK的重组质粒、含TACPHE的重组质粒和含MTRD的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述含有cas9蛋白的质粒包括pCas9。在本专利技术的一种实施方式中，含有sgRNA的线性化载体包括pTT7A、pTPH或pTMT。在本专利技术的一种实施方式中，pTT7A的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，pTPH的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，pTMT的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。在本专利技术的一种实施方式中，pCas9的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。本专利技术的第三个目的是提供上述的重组大肠杆菌在生产L-色氨酸中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括将平板培养基中34-38℃下培养22-26h的单菌落接种至种子培养基，于34-38℃、180-220rpm条件下培养5-8h，再以20％的接种量接种发酵培养基，34-38℃、180-220rpm条件下培养10-14h，0.1mMIPTG诱导45-50h。本专利技术的第四个目的是提供上述的重组大肠杆菌在饲料、制药、保健品或食品工业中的应用。本专利技术是以大肠杆菌CICC10303作为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，替换莽草酸激酶编码基因aroK启动子为强启动子T7；替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为弱启动子tac；敲除色氨酸转运体编码基因mtr，阻止发酵过程色氨酸转运回胞内。最终得到积累L-色氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到36g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸奠定了基础。本专利技术提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。附图说明图1：质粒图谱，A：pTT7A；B：pTPH；C：pTMT。图2：重组大肠杆菌CICC10303-TRYP在不同培养条件下色氨酸的产量。图3：仅替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子，在35℃条件下发酵重组菌生产L-色氨酸。图4：仅替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子，在35℃条件下发酵重组菌生产L-色氨酸。图5：仅敲除色氨酸转运体编码基因mtr，在35℃温度条件下发酵重组菌生产L-色氨酸。具体实施方式重组大肠杆菌种子培养及发酵培养基：平板培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠5，琼脂粉15，pH调至7.0。种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉15.2，磷酸氢二钾24，硫酸铵5，磷酸二氢钾9.6，七水硫酸镁1。发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，七水硫酸镁16，硫酸铵24，酵母浸出粉10，柠檬酸三钠二水物16，磷酸氢二钾5.6。培养条件：将37℃下培养24h的平板挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，10％的接种量接种发酵培养基，35℃、220rpm条件下培养42h。L-色氨酸的测定方法：1.样品处理：取1mL发酵液，离心去除菌体取上清。用5％的三氯乙酸将上清液适当稀释后12000rpm/min离心10min，然后经孔径为0.22μm的滤膜过滤。2.分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产L‑色氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，替换了莽草酸激酶基因aroK启动子为T7启动子，敲除了色氨酸转运体编码基因mtr并替换了预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子。

【技术特征摘要】
1.一种产L-色氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，替换了莽草酸激酶基因aroK启动子为T7启动子，敲除了色氨酸转运体编码基因mtr并替换了预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子。2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的tac启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，是对大肠杆菌CICC10303进行基因组编辑得到的。4.如权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。5.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)构建T7启动子替换重组片段、tac启动子替换重组片段以及敲除mtr基因重组片段：将大肠杆菌莽草酸激酶编码基因aroK基因簇起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T7AROK；将预苯酸脱氢酶编码基因pheA的起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入启动子tac，得到片段TACPHE；将色氨酸转运体编码基因mtr上下游同源臂融合，得到片段MTRD。2)构建重组质粒：将片段T7AROK、TACPHE、MTRD分别与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到重组质粒含T7AROK的重组质粒、含TACPHE的重组质粒、含MTRD的重组质粒；3)构建重组大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈泰驰，李江华，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32