一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述胞外结构域包括抗BCMA和抗CD19的抗原结合域。本发明专利技术的嵌合抗原受体有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效缩小实体瘤灶，有效提高肿瘤的治疗效果。

A Bispecific Chimeric Antigen Receptor Targeting BCMA and CD19 and Its Application

The invention relates to a bispecific chimeric antigen receptor targeting BCMA and CD19 and its application. The chimeric antigen receptor comprises an extracellular domain, a transmembrane domain and at least one intracellular domain capable of binding antigens. The extracellular domain includes an antigen binding domain of anti-BCMA and anti-CD19. The chimeric antigen receptor of the invention has less clinical side effects and higher safety, can effectively reduce solid tumour focus and effectively improve the therapeutic effect of tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用，具体为以特异靶点BCMA和CD19为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
目前，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤的临床试验中已取得了令人欣喜的结果，为CAR技术治疗复发难治性多发性骨髓瘤(MM)带来了曙光。多发性骨髓瘤是一种起源于骨髓中浆细胞的恶性疾病，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。BCMA(CD269)表达于成熟的B细胞和浆细胞，在MM中也有广泛的表达。针对BCMA的ADC药物(GSK2857916)和双靶向抗体药物(BI836909)现正处于一期临床和临床前研发过程中。目前以B细胞成熟抗原(BCellMaturationAntigen，BCMA，CD269)为靶点而开发的新一代CAR-T的多个临床试验数据显示，靶向BCMA的CAR-T疗法在多发性骨髓瘤的治疗中取得巨大成功。然而，类似于CD19CAR试验中B细胞急性淋巴细胞白血病复发，BCMA-CAR治疗观察到MM复发，BCMA阳性和BCMA阴性恶性细胞复发。前者表明缺乏效力和持久性，后者表明抗原通过的选择性压力逃逸。最初认为发性骨髓瘤起源于浆细胞的恶变，免疫学和分子生物学研究提示：多发性骨髓瘤起源于前B细胞恶变，或起源于较前B更早的造血前体细胞的恶变。因此，清除早期起源的恶变的B细胞将极大提高多发性骨髓瘤的治疗效果，延缓复发。此外，多发性骨髓瘤作为B细胞系肿瘤通常不表达CD19，因此CD19不作为多发性骨髓瘤免疫治疗的靶标。然而有一些报告指出，微量的具有耐药性，疾病复发特性的多发性骨髓瘤克隆，具有B细胞表型(即CD19阳性)。去年UPenn和Novartis在NEJM上报道的文章指出，多发性骨髓瘤肿瘤干细胞特性是CD19阳性。一例被报道的多发性骨髓瘤病例中，尽管99.5％的恶性增生的浆细胞上都缺乏CD19的表达，但经过只针对CD19的CAR-T治疗后该患者依旧获得完全治愈。因此，CD19是清除复发、难治和抗药性多发性骨髓瘤细胞的潜在治疗靶标。采用BCMA抗原作为胞外域用于治疗B细胞相关疾病都有公开，但是抗原结合结构域结合得太强，那么CART细胞诱导大规模细胞因子释放，导致视为“细胞因子风暴”的可能致死的免疫反应；但如果抗原结合结构域结合太弱，那么CART细胞无法在清除癌细胞方面呈现充足治疗功效。而现有技术中，CN106687483A公开了人源化抗BCMA嵌合抗原受体治疗癌症，其通过施用表达CAR遗传修饰的T细胞的方法，从而实现治疗与B细胞成熟抗原蛋白(BCMA)的表达相关的疾病。CN104788573A公开了了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该专利中的CD19在进行一次CAR-T细胞回输后，CD19的表达量会降低，容易逃过免疫机制。因此，制备一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体，不仅有效提高T细胞的杀伤作用且能够有效避免靶点逃逸，必能提供多发性骨髓瘤一个更有效的治疗选择。
技术实现思路
针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本专利技术提供一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用，本专利技术制备的嵌合抗原受体不仅能够有效提高T细胞杀伤信号并且可以有效地避免发生靶点逃逸现象引起的多发性骨髓瘤复发。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体，所述包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述胞外结构域包括抗BCMA和抗CD19的抗原结合域。根据本专利技术，所述胞外结构域为抗BCMA和抗CD19的单链抗体或抗BCMA和抗CD19的单域抗体，其中，对于抗BCMA抗原结合域和抗CD19抗原结合域的顺序对于嵌合抗原的效果不会造成影响，连接顺序例如可以是抗BCMA抗原结合域-linker-抗CD19抗原结合域，或抗CD19抗原结合域-linker-抗BCMA抗原结合域，这样的顺序的调整都不会对嵌合抗原受体的效果产生影响。本专利技术中，专利技术人发现通过将抗BCMA抗体和抗CD19抗体采用linker连接后，得到的双特异性抗体制备成嵌合抗原受体，不仅能够有效提高T细胞加强杀伤信号，还能有效避免发生靶点逃逸现象，不仅如此，专利技术人还发现抗BCMA抗原结合域和抗CD19抗原结合域的连接顺序不会对嵌合抗元受体的效果产生影响，本专利技术中将BCMA-linker-CD19命名为B(G)19，将CD19-linker-BCMA命名为19(G)B。根据本专利技术，所述抗BCMA和抗CD19的双特异性抗体中的抗BCMA的抗原结合域和抗CD19的抗原结合域采用linker连接，本申请选用的是(G4S)3linker序列，具体如下：(G4S)3Linker的氨基酸序列(SEQIDNO.9)：GGGGSGGGGSGGGGS；(G4S)3Linker的核苷酸序列(SEQIDNO.10)：GGCGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGcGGAGGAAGC.根据本专利技术，优选地，所述抗BCMA和抗CD19的抗原结合域的氨基酸序列如SEQIDNO.1-2所示，具体序列如下：BCMA-linker-CD19B(G)19(SEQIDNO.1)：DIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAAIYYCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQGLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT；CD19-linker-BCMA19(G)B(SEQIDNO.2)：EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述胞外结构域包括抗BCMA和抗CD19的抗原结合域。

【技术特征摘要】
1.一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述胞外结构域包括抗BCMA和抗CD19的抗原结合域。2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外结构域为抗BCMA和抗CD19的单链抗体或抗BCMA和抗CD19的单域抗体；优选地，所述抗BCMA和抗CD19的双特异性抗体中的抗BCMA抗体和抗CD19抗体采用linker连接；优选地，所述抗BCMA和抗CD19的抗原结合域的氨基酸序列如SEQIDNO.1-2所示；优选地，所述抗BCMA和抗CD19的抗原结合域的核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示。3.根据权利要求1或2所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；优选地，所述胞内结构域还包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；优选地，所述共刺激信号传导结构域为人4-1BB胞内区、人CD28胞内区、人CD27胞内区、人OX40胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区或人OX40胞内区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人4-1BB胞内区；优选地，所述胞外结构域和跨膜结构域是通过铰链区连接的；优选地，所述铰链区包含IgG1铰链区和/或CD8α铰链区；优选地，所述双特异性嵌合抗原受体还包括信号肽，优选为CD8α信号肽或Secretory信号肽。4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述双特异性嵌合抗原受体包括信号肽、结合BCMA和CD1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李光超，郭锦涛，丁雯，曾剑华，罗敏，莫文俊，
申请(专利权)人：广州百暨基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44