通过质谱法鉴定和定量抗体药物缀合物中的缀合肽制造技术

本公开涉及一种用于对来自抗体药物缀合物(ADC)化合物中的缀合肽进行定性和定量分析的流线型完整工作流程。

Identification and Quantification of Binding Peptides in Antibody Drug Conjugates by Mass Spectrometry

The present disclosure relates to a streamlined complete workflow for qualitative and quantitative analysis of conjugated peptides from antibody drug conjugates (ADC) compounds.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过质谱法鉴定和定量抗体药物缀合物中的缀合肽相关申请的交叉引用本申请要求2016年3月2日提交的美国临时申请No.62/302,333的权益和优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
本公开涉及一种用于对来自抗体药物缀合物(ADC)化合物中的缀合肽进行定性和定量分析的流线型完整工作流程。
技术介绍
抗体药物缀合物(ADC)化合物代表一类不断增长的免疫缀合物疗法。ADC化合物是由单克隆抗体构成的复合分子，所述单克隆抗体经由可裂解接头(例如，酸不稳定接头、蛋白酶可裂解接头和二硫化物接头)或不可裂解接头连接到具有生物活性的高细胞毒性药物上。有效药物与单克隆抗体的缀合使得能够将毒性有效载荷靶向递送到肿瘤表面，同时使对健康组织的全身毒性作用最小化，从而改善这类癌症治疗方式的治疗窗口。缀合过程不完全可产生游离或非缀合药物、药物-接头或药物相关杂质。另外，降解产物可随时间在制剂中以及在体内出现。因此，对ADC进行结构表征和定性分析都具有挑战性。传统上，使用UV方法完成了缀合肽的定量和位点占用比率测定。UV定量的缺点包括灵敏度低、选择性不足以及分析时间相对长。与基于UV的方法相比，基于MS的定量可提供更高的选择性和灵敏度。然而，迄今为止，生物制药行业仍然缺乏能够有效鉴定和定量ADC肽的完整工作流程。
技术实现思路
本公开涉及一种用于对来自抗体药物缀合物(ADC)化合物中的缀合肽进行定性和定量分析的流线型完整工作流程。因此，本文提供了用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法。该方法的一个实施例包括两个步骤。一个步骤涉及电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。电离的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。另一个步骤涉及检测与自由基离子片段相关联的质荷比。该方法的另一个实施例包括至少三个步骤。一个步骤涉及提供包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。另一个步骤涉及将样品暴露于脱盐中。另一个步骤涉及将样品暴露于多酶消化中。然后电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。电离的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。随后，检测与自由基离子片段相关联的质荷比。该方法的又一个实施例包括三个步骤。一个步骤涉及电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。电离的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。另一个步骤涉及检测与自由基离子片段相关联的质荷比。另一个步骤涉及选择自由基离子片段的两组独立的质荷比。第一组质荷比可与缀合肽的自由基离子片段相关联。第二组质荷比可与未缀合肽的自由基离子片段相关联。该方法的再一个实施例包括三个步骤。一个步骤涉及电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。电离的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。另一个步骤涉及检测与自由基离子片段相关联的质荷比。另一个步骤涉及监测自由基离子片段的两组独立的质荷比。第一组质荷比可与缀合肽的自由基离子片段相关联。第二组质荷比可与未缀合肽的自由基离子片段相关联。本文提供的方法使得能够分析自由基离子片段的质荷比，以确定抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。本文提供的方法的上述实施例具有以下一个或多个优点。例如，某些实施例提供了一种流线型工作流程，其消除了用于鉴定和定量ADC肽的复杂步骤。某些其他实施例提供了比之前的工作流程更高的选择性和灵敏度。附图说明图1是示出本专利技术的方法的一个实施例的示意图。图2是示出本专利技术的方法的替代实施例的示意图。图3是T-DM1缀合的示意图，其中曲妥珠单抗上的赖氨酸被SMCC接头修饰，并且随后与DM1药物的巯基反应。MCC-DM1表示MCC-DM1，MCC表示接头。MCC-DM1＝956.3644，MCC＝219.0895。图4是去糖基化原创药ADC和去糖基化生物仿制药候选ADC之间的完整质量比较：(A)组合原始质谱，m/z范围为2200-3600；以及(B)解卷积质谱(UNIFI1.8使用MaxEnt1处理)，两种ADC都用PNGFase处理。标记0、1、…、n对应于通过接头与n个DM1分子连接的Tmab。计算DAR并在图上显示。图5表示用于胰蛋白酶消化的原创药和生物仿制药的LC-MSE胰蛋白酶肽图谱的镜像图。(A)LC/MS基峰强度色谱图(BPI)。(B)LC/UV252nm。图6是含有赖氨酸位点K65的肽的解卷积MS/MS谱。(A)胰蛋白酶肽HC60-67。(B)Asp-N肽HC62-72。图7示出了与含有来自原创药和生物仿制药ADC的Asp-N消化物中的位点K65的DM1的(A)未缀合的CDR肽和(B)缀合的肽的提取离子色谱图(XIC)的镜像图。计算缀合肽的相对峰面积并在图上标记。图8A示出了比较原创药和生物仿制药ADC的来自胰蛋白酶消化物中的缀合肽的相对峰面积。赖氨酸缀合的位点在X轴上标记。图8B示出了每个区域中缀合肽即可变Fab、恒定Fab、CH2和CH3的强度总和。图9描绘了ADC样品的DSC热谱图。图10A示出了ADC样品的聚集体含量的SEC-HPLC分析。图10B示出了在还原条件下ADC样品的CE-SDS分析。图11示出了ADC样品的游离药物含量。图12A是ADC样品的细胞毒活性的图。图12B是ADC样品与HER2蛋白的结合活性的图。具体实施方式现在将详细参考本专利技术的某些实施例，这些实施例的示例在附图中示出。虽然将结合列举的实施例描述本专利技术，但是应当理解，它们并不旨在将本专利技术限制于那些实施例。相反，本专利技术旨在涵盖所有替代型式、修改型式和等同型式，这些型式可包括在由权利要求限定的本专利技术的范围内。本领域技术人员将认识到许多类似于或等同于本文所述的方法和材料的方法和材料，这些方法和材料可用于本专利技术的实践中。本专利技术决不限于所述的方法和材料。定义除非另有说明，否则本文使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：如本文所用，“抗体药物缀合物”或“ADC”是通过具有不稳定键的化学接头附接到具有生物活性的药物上的单克隆抗体(mAb)。“抗体”在本文中以最广泛意义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或可来自其他物种。抗体是由免疫系统产生的蛋白质，其能够识别并结合特定抗原。(Janeway等人，(2001)“Immunobiology”，第5版，GarlandPublishing，NewYork)。靶抗原通常具有许多结合位点(也称为表位)，由多个抗体上的CDR识别。特异性结合不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有一种以上的相应抗体。抗体还指全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合感兴趣靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，所述靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。免疫球蛋白可来源于任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。术语“接头单元”是指抗体与药物的直接或间接连接。接头与mAb的附接可以多种方式完成，诸如通过表面赖氨酸、还原偶联到氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法，所述方法包括：(i)电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品，以形成所述抗体药物缀合物化合物和所述肽的自由基离子片段；(ii)检测与所述自由基离子片段相关联的质荷比；以及(iii)分析所述自由基离子片段的所述质荷比，以确定所述抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.02 US 62/3023331.一种用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法，所述方法包括：(i)电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品，以形成所述抗体药物缀合物化合物和所述肽的自由基离子片段；(ii)检测与所述自由基离子片段相关联的质荷比；以及(iii)分析所述自由基离子片段的所述质荷比，以确定所述抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。2.根据权利要求1所述的方法，还包括鉴定所述样品中的所述肽。3.根据权利要求1所述的方法，还包括定量所述样品中的所述肽。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述肽包含缀合肽和未缀合肽。5.根据权利要求4所述的方法，还包括通过确定缀合肽与未缀合肽的比率来定量所述样品的位点占用比率。6.一种用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法，所述方法包括：(i)提供包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品；(ii)将所述样品暴露于脱盐中；(iii)将所述样品暴露于多酶消化中；(iv)电离所述样品以形成所述抗体药物缀合物化合物和所述肽的自由基离子片段；(v)检测与所述自由基离子片段相关联的质荷比；以及(vi)分析所述自由基离子片段的所述质荷比，以确定所述抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。7.根据权利要求6所述的方法，还包括鉴定所述样品中的所述肽。8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述肽包含缀合肽和未缀合肽。9.根据权利要求8所述的方法，还包括选择所述自由基离子片段的两组独立的质荷比。10.根据权利要求9所述的方法，其中第一组质荷比与所述缀合肽的所述自由基离子片段相关联。11.根据权利要求9所述的方法，其中第二组质荷比与所述未缀合肽的所述自由基离子片段相关联。12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中选择所述两组独立的质荷比基于已知离子片段化模式进行。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述已知离子片段化模式存储在库中。14.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，还包括定量所述样品中的所述肽。15.根据权利要求14所述的方法，还包括通过确定缀合肽与未缀合肽的比率来定量所述样品中的位点占用比率。16.根据权利要求6至15中任一项所述的方法，其中所述多酶消化包括第一酶和第二酶。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一酶是胰蛋白酶/LysC。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述胰蛋白酶/LysC与样品的比率为约1:25(w/w)。19.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈柳西，W陈，S库贝奇，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US