纯化方法及其用途技术

给出了循环色谱纯化方法，其用于从由产物和代表杂质的至少一种另外的组分组成的进料混合物中分离所述产物，与所述产物相比，所述杂质与色谱固定相结合得更牢固。所述方法使用作为色谱固定相的至少两个色谱吸附器，其分组为仅一个第一吸附器部分(1)和一个第二吸附器部分(2)，其中如果吸附器部分包含多于一个色谱吸附器，则这些色谱吸附器永久地串联连接，其中所述第一吸附器部分(1)具有第一吸附器部分入口和第一吸附器部分出口，并且所述第二吸附器部分(1)具有第二吸附器部分入口和第二吸附器部分出口。

Purification method and its application

A method of cyclic chromatographic purification is presented for separating the product from a feed mixture consisting of a product and at least one other component representing the impurity. Compared with the product, the impurity is more firmly bound to the chromatographic stationary phase. The method uses at least two chromatographic adsorbents as chromatographic stationary phases, which are grouped into only one first adsorber part (1) and one second adsorber part (2). If the adsorber part contains more than one chromatographic adsorber, these chromatographic adsorbents are permanently connected in series. The first adsorber part (1) has the entrance of the first adsorber part and the first adsorption. The second adsorber part (1) has a second adsorber part inlet and a second adsorber part outlet.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化方法及其用途
本专利技术涉及循环色谱纯化方法(cyclicchromatographicpurificationmethod)，特别是用于纯化包含抗体之治疗性蛋白质的精制色谱法(polishingchromatography)。
技术介绍
用于纯化活性物质(例如治疗性蛋白质和肽)的色谱方法通常包括多个单独的色谱步骤。目的产物通常伴有多种必须除去的杂质。在色谱法中，利用了目的产物和杂质与固定相(即吸附剂材料)的不同相互作用。固定相包含在适于色谱操作的容器(通常是柱或膜吸附器)中并且该组合在下文中称为“吸附器(adsorber)”。目的产物和杂质与固定相的相互作用强烈地取决于它们的分子特性(例如电荷和尺寸)，这进而又受到泵送通过吸附器且其中溶解产物和杂质的液体的特性的影响。通过改变流过吸附器的液体(所谓的流动相)的特性，可以以实现分离的方式改变产物或杂质的结合特性。在某些条件下，可促进产物与固定相的结合(吸附)，而在另一些条件下，反而可促进产物的非结合(解吸)。这同样适用于杂质。流动相的典型改变涵盖离子强度、pH值或者有机溶剂含量或组成的变化。在所谓的结合/洗脱色谱(例如在亲和色谱中)中，选择流动相条件使得目的产物与固定相结合，而杂质流过。在固定相已被加载一定量的产物之后，通常用流动相洗涤吸附剂，其从吸附剂中除去残留的杂质，留下产物吸附在固定相上。为了回收产物，于是改变流动相条件，使得目的产物与固定相之间的相互作用被破坏，并且所述产物被释放并被从吸附剂中洗出以用于收集。色谱纯化序列(chromatographicpurificationsequence)的第一步通常是结合/洗脱过程，因为其能够浓缩包含在稀释的原料中的产物并且除去杂质。在某种意义上，结合/洗脱过程是不连续的，离开吸附器的流(stream)中的产物浓度随时间不恒定。在其中产物在连续反应器中合成的某些应用中，还期望以连续模式运行色谱纯化序列以使中间的保持/储存步骤减至最少。在流通色谱(flow-throughchromatography)中，选择流动相的条件和固定相，使得杂质比目的产物更牢固地吸附在固定相上，这允许产物在杂质之前通过吸附器。在流通色谱中，在恒定的进料(feed)和产物流量下连续操作是可能的，但是由于进料和产物流的量级相同，因此不能实现显著的产物浓度提高。一般的流通方法包括平衡步骤、加载步骤和再生步骤。在加载步骤期间回收产物。在再生步骤中，清洁吸附器并使其再平衡以清除结合的杂质并且使吸附器准备用于下一次运行。如果加载步骤比再生步骤长，则两个并排工作的流通吸附器可确保连续的进料和出口流，其仅通过开关吸附器的入口和出口(“触发器(flip-flop)”操作)而中断。当开发流通方法时，色谱工作人员试图改变加载材料的条件(例如离子强度和pH)，以使目的产物不被吸附并通过吸附器，而杂质被牢固地吸附并且完全保留。然而，在杂质和目的产物具有非常类似的吸附特性的情况下，达到这个目标可以是不可能的，并且替代地，只可找到其中杂质比产物稍微更牢固地吸附在固定相上的条件，使得达到可接受的产物纯度。显然，在类似的吸附特性的条件下，随着吸附器的加载的进行，离开吸附器以用于收集的产物之后紧接着杂质，导致对于产物的低有效容量(effectivecapacity)。换言之，吸附特性(通常通过所谓的保留因子来量化)与容量相关，并且如果前者对于产物和杂质类似，则后者也倾向于类似。吸附器对于杂质的低容量意味着与在对于杂质具有高容量的条件下相比，在开始加载之后必须快得多地停止加载，并且必须清洁吸附器并使其再生以用于下一次运行。这意味着生产率(其被定义为单位时间和单位吸附器体积使用该方法纯化的产物的量)降低，因为每个循环产生较少的产物。因此，较低的容量导致较低的生产率。其中选择加载条件以使一些较牢固吸附的化合物被完全保留而另一些较不牢固吸附的杂质根本不被保留的方法将递送低纯度的产物，因为较不牢固吸附的杂质与产物一起流过。当以这种方式操作时，可实现导致高生产率(即，单位时间和吸附器体积产生更大量的产物)的高加载体积，因为杂质的仅一部分被保留但产物可不符合规格。这表明，在现有技术的流通方法中，在生产率与产物纯度之间存在折衷。在杂质与产物的比例高的情况下，所述折衷更加明显，例如像在单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)细胞培养物收获中的聚集体的情况(其中已经报道0.5％至15％聚集体的水平)下。在痕量污染物(例如通常以ppm量(百万分率(partpermillion))存在于进料材料中的宿主细胞蛋白质、DNA和病毒)去除的情况下，所述折衷不太明显。总之，当产物和杂质具有类似的吸附特性时，例如在产物相关的杂质去除的许多情况下，在流通色谱中获得高纯度和高生产率的目的是相互排斥的。
技术实现思路
本专利技术旨在减轻现有技术方法的生产率与产物纯度的折衷以获得具有高生产率和产物纯度的流通方法。所有流通方法都需要解决在加载阶段结束时如何回收留在吸附器中的产物的挑战。该产物只能通过用流动相洗涤来回收，调节该流动相以使产物被洗出而杂质留在吸附器中。在实践中，这可非常难以实现，并且为了不违反纯度规格，可能不可避免地留下产物的一部分。然后在随后的清洁步骤中该产物被清除并丢失，降低了该方法的收率。在高容量下工作的流通色谱的另一种变化利用了置换效应(displacementeffect)：通过选择合适的流动相特性，可强烈提高吸附器对于产物和杂质二者的容量。当对吸附器进行加载时，产物和杂质二者都牢固地保留在吸附器上，并且在加载期间，由于产物在吸附器中积聚，最初没有产物从吸附器洗脱。随着加载的进行，甚至比产物更牢固地吸附在固定相上的杂质从固定相中置换产物，最终将其推出吸附器。通常来说，流通方法可达到比结合/洗脱步骤更高的加载度(loadingrate)，尤其是进料中低杂质浓度的情况下，这导致吸附器被杂质非常缓慢的饱和并且确保了长的加载时间。已经报道了对于流通操作每升吸附器加载10,000至20,000g的mAb，而在结合/洗脱色谱中，可实现每升吸附器约200gmAb的最大加载，这低100倍。流通色谱的一个缺点是不可能从较弱吸附的目的产物中分离化合物。此外，杂质本身可包含多种化合物，其中一些表现出与产物类似的吸附特性，而一些具有非常不同的吸附特性。如前所述，为了获得高产物纯度，必须调节加载条件以使产物比大多数杂质吸附得更弱。由于以下原因，所提出的方法与具有两个或更多个吸附器的周期性逆流方法(例如在WO2014166799中公开的一种)从根本上不同：1.在本专利技术方法中，目的化合物(即产物)流过吸附器，而在现有技术方法中其保留在吸附器上。这在间歇阶段(batchphase)和互连阶段(interconnectedphase)都适用。2.在所提出方法的“间歇”阶段，产物回收和再生步骤解耦并在单独的吸附器上进行。在根据WO2014166799的方法和另一些方法中，这些任务在“间歇”阶段B中在相同的吸附器上进行。3.在本专利技术的方法中，在吸附器的互连状态下使用管线内稀释(inlinedilution)步骤，确保从第一吸附器部分突破的化合物在第二吸附器部分上被再吸附并且不污染流过的产物化合物。管线本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种循环色谱纯化方法，其用于从由产物和代表杂质的至少一种另外的组分组成的进料混合物中分离所述产物，与所述产物相比，所述杂质与色谱固定相结合得更牢固，所述方法使用至少两个作为色谱固定相的色谱非亲和吸附器，其分组为仅一个第一吸附器部分(1)和一个第二吸附器部分(2)，其中如果吸附器部分包括多于一个色谱吸附器，则这些色谱吸附器永久地串联连接，其中所述第一吸附器部分(1)具有第一吸附器部分入口和第一吸附器部分出口，并且所述第二吸附器部分(2)具有第二吸附器部分入口和第二吸附器部分出口，所述方法按顺序包括以下步骤：a.第一互连步骤(ICla)，其中在第一互连时间段(tICa)期间所述第一吸附器部分出口连接至所述第二吸附器部分入口，其中所述第一吸附器部分(1)通过所述第一吸附器部分入口加载有进料混合物，并且其中从所述第二吸附器部分出口收集产物；b.第二互连步骤(IClb)，其中在第二互连时间段(tICb)期间所述第一吸附器部分出口连接至所述第二吸附器部分入口，其中所述第一吸附器部分(1)通过所述第一吸附器部分入口加载有第一洗涤缓冲液以将所述第一吸附器部分(1)中未结合的产物转移到所述第二吸附器部分(2)中，并且其中离开所述第一吸附器部分出口的流在进入所述第二吸附器部分入口之前被管线内稀释或者补充有进料混合物并且其中从所述第二吸附器部分出口收集产物；c.第一间歇步骤(B1)，其中在间歇时间段(tB)期间，所述第一和第二吸附器部分(1，2)断开连接，并且其中所述第一吸附器部分(1)被清洁和再生以除去杂质并且所述第一吸附器部分出口导向废物并且其中所述第二吸附器部分入口加载有第二洗涤缓冲液或者加载有进料混合物并且从所述第二吸附器部分出口收集产物；d.第三互连步骤(IC2a)，其中所述第一吸附器部分(1)执行所述第一互连步骤中所述第二吸附器部分(2)的任务，并且所述第二吸附器部分(2)执行所述第一互连步骤中所述第一吸附器部分(1)的任务；e.第四互连步骤(IC2b)，其中所述第一吸附器部分(1)执行所述第二互连步骤中所述第二吸附器部分(2)的任务，并且所述第二吸附器部分(2)执行所述第二互连步骤中所述第一吸附器部分(1)的任务；f.第二间歇步骤(B2)，其中所述第一吸附器部分(1)执行所述第一间歇步骤中所述第二吸附器部分(2)的任务，并且所述第二吸附器部分(2)执行所述第一间歇步骤中所述第一吸附器部分(1)的任务。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.13 EP 16179273.41.一种循环色谱纯化方法，其用于从由产物和代表杂质的至少一种另外的组分组成的进料混合物中分离所述产物，与所述产物相比，所述杂质与色谱固定相结合得更牢固，所述方法使用至少两个作为色谱固定相的色谱非亲和吸附器，其分组为仅一个第一吸附器部分(1)和一个第二吸附器部分(2)，其中如果吸附器部分包括多于一个色谱吸附器，则这些色谱吸附器永久地串联连接，其中所述第一吸附器部分(1)具有第一吸附器部分入口和第一吸附器部分出口，并且所述第二吸附器部分(2)具有第二吸附器部分入口和第二吸附器部分出口，所述方法按顺序包括以下步骤：a.第一互连步骤(ICla)，其中在第一互连时间段(tICa)期间所述第一吸附器部分出口连接至所述第二吸附器部分入口，其中所述第一吸附器部分(1)通过所述第一吸附器部分入口加载有进料混合物，并且其中从所述第二吸附器部分出口收集产物；b.第二互连步骤(IClb)，其中在第二互连时间段(tICb)期间所述第一吸附器部分出口连接至所述第二吸附器部分入口，其中所述第一吸附器部分(1)通过所述第一吸附器部分入口加载有第一洗涤缓冲液以将所述第一吸附器部分(1)中未结合的产物转移到所述第二吸附器部分(2)中，并且其中离开所述第一吸附器部分出口的流在进入所述第二吸附器部分入口之前被管线内稀释或者补充有进料混合物并且其中从所述第二吸附器部分出口收集产物；c.第一间歇步骤(B1)，其中在间歇时间段(tB)期间，所述第一和第二吸附器部分(1，2)断开连接，并且其中所述第一吸附器部分(1)被清洁和再生以除去杂质并且所述第一吸附器部分出口导向废物并且其中所述第二吸附器部分入口加载有第二洗涤缓冲液或者加载有进料混合物并且从所述第二吸附器部分出口收集产物；d.第三互连步骤(IC2a)，其中所述第一吸附器部分(1)执行所述第一互连步骤中所述第二吸附器部分(2)的任务，并且所述第二吸附器部分(2)执行所述第一互连步骤中所述第一吸附器部分(1)的任务；e.第四互连步骤(IC2b)，其中所述第一吸附器部分(1)执行所述第二互连步骤中所述第二吸附器部分(2)的任务，并且所述第二吸附器部分(2)执行所述第二互连步骤中所述第一吸附器部分(1)的任务；f.第二间歇步骤(B2)，其中所述第一吸附器部分(1)执行所述第一间歇步骤中所述第二吸附器部分(2)的任务，并且所述第二吸附器部分(2)执行所述第一间歇步骤中所述第一吸附器部分(1)的任务。2.根据权利要求1所述的方法，其中每个吸附器部分(1，2)由仅一个吸附器组成，使得所述方法中吸附器的总数是2。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在第一次实施所述第一互连步骤之前实施启动步骤(BSU)，其中在间歇时间段(tBsU)期间所述吸附器部分(1，2)断开连接并且在随后的第一互连步骤中将替代所述第一吸附器部分(1)的经平衡吸附器部分(1)通过所述第一吸附器部分入口加载有进料混合物，并且从第一吸附器部分出口收集产物，而所述第二吸附器部分(2)正被平衡或已被平衡并且待用。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤a.至f.的期望的循环终止之后，该过程之后是关闭序列(BSD)，其中在第一间歇时间段(tBSDa)期间所述吸附器部分(1，2)断开连接，并且洗涤在前述第二间歇步骤(B2)中经受洗涤的所述吸附器部分使得从所述吸附器部分出口收集产物；并且其中在第二时间段...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·米勒斯帕思，拉尔斯·奥曼，迈克尔·巴万德，
申请(专利权)人：克罗麦肯公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH