基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器及检测方法技术

基于铜‑六羟基三亚苯的miRNA‑21电化学传感器及检测方法，其为三电极体系传感器，所述的三电极中的辅助电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极为基于铜‑六羟基三亚苯的miRNA‑21电极，其特征在于：所述的基于铜‑六羟基三亚苯的miRNA‑21电极上修饰有Cu‑CAT膜，Cu‑CAT膜上吸附有ExoⅢ酶剪切DNA/miRNA‑21后的核苷酸产物。利用Cu‑CAT与ExoⅢ酶剪切得到的寡聚核苷酸产物之间特异性的疏水性π‑Π堆积作用，实现了HCC生物标志物的高灵敏、快速、免探针固定的传感分析。

MicroRNA-21 electrochemical sensor based on copper-hexahydroxytribenzene and its detection method

The microRNA21 electrochemical sensor and detection method based on copper hexahydroxytribenzene is a three-electrode system sensor. The auxiliary electrode in the three electrodes is a platinum electrode, the reference electrode is an Ag/AgCl electrode, and the working electrode is a microRNA21 electrode based on copper hexahydroxytribenzene. The microRNA21 electrode based on copper hexahydroxytribenzene is modified with a platinum electrode. The nucleotide products of exo III cleavage DNA/microRNA21 were adsorbed on the Cu CAT membrane and Cu CAT membrane. The specific hydrophobic pi_accumulation between the oligonucleotide products cleaved by Cu CAT and Exo III enzymes was used to achieve a highly sensitive, rapid and probe-free sensing analysis of HCC biomarkers.

【技术实现步骤摘要】
基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器及检测方法
本专利技术涉及电化学检测领域，尤其是基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器及检测方法。
技术介绍
微小RNA(miRNA)是一种无细胞状态的胞外核酸，广泛存在于外周血、脑脊液和尿液等体液中。近年大量研究已表明，miRNA-21与肝细胞癌(HCC)的发生、转移和耐药性密切相关，可作为HCC的特异生物标志物。因此建立快速、准确、灵敏的miRNA-21检测技术HCC的早期预警、治疗和肝癌演进分子机制研究具有重要意义。电化学核酸传感器具有易微型化、灵敏度高、仪器简便等优点，经常应用于miRNA的检测。目前的电化学核酸传感器主要有探针固定型和免探针固定型。与探针固定型相比，免探针固定型核酸传感器具有更快的杂交反应速度和更高的杂交有效性，但同时也存在信号分子标记过程复杂、由动力学扩散差异引起的信号变化受检测环境影响大、信号分子及基底电极种类单一等缺点。因此，如何通过方法学上的设计在保留免固定miRNA电化学传感器优势的同时，进一步进行信号分子免标记处理、丰富信号源和传感界面类型是该类传感器性能和应用提升的突破口。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效吸附并影响Cu-CAT电化学信号达到对miRNA-21免探针固定的快速、灵敏、特异检测的基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器及检测方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器，其为三电极体系传感器，所述的三电极中的辅助电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极为基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电极，其特征在于：所述的基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电极上修饰有Cu-CAT膜，Cu-CAT膜上吸附有ExoⅢ酶剪切DNA/miRNA-21后的核苷酸产物。进一步的，所述的基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器，以Cu作为信号源，RNA作为目标链，在miRNA-21的浓度范围为0.01-10nmol/L的情况下，Cu-CAT还原峰电流(Ip)与互补序列浓度对数值(lgCmiRNA-21)呈良好的线性关系。基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器的检测方法，具体如下：步骤一：依次采用i-t法和循环伏安法在玻碳电极修饰上Cu和CAT，进而使二者反应形成Cu-CAT膜，形成Cu-CAT修饰玻碳电极；步骤二：将与miRNA-21互补配对的DNA与miRNA-21混合，培养形成DNA-RNA复合链后，加入ExoⅢ剪切酶，反应得到RNA及DNA碎片，再将步骤一制得的Cu-CAT修饰玻璃电极浸入该溶液中反应，然后用二次蒸馏水淋洗，得到基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电极。步骤三：将步骤二电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，建立三电极体系传感器，在检测液中进行微分脉冲伏安法检测，得到响应电流的数值。步骤四：更换miRNA-21的浓度，重复步骤二和步骤三，测得不同miRNA-21浓度下对应的响应电流，计算出响应电流与miRNA-21浓度的线性关系。步骤五：对待检测样进行步骤二到步骤三的过程，得到对应的响应电流数值，利用步骤四所得的线性关系计算出miRNA-21浓度。进一步的，所述的基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器的检测方法，具体步骤如下：步骤一：将预处理过的玻碳电极置于Cu(NO3)2和N,N-甲基吡咯烷酮(NMP)混合液中进行i-t法扫描电沉积Cu单质膜，Cu(NO3)2的浓度为1～1000mmol/L，N,N-甲基吡咯烷酮(NMP)的浓度为1～1000mmol/L；然后将电极在CAT和NMP混合液中进行循环伏安法扫描，CAT的浓度为1-1000mmol/L，NMP的浓度为1-1000mmol/L，然后用二次蒸馏水洗涤，得到Cu-CAT修饰传感电极，记为：Cu-CAT/GCE；步骤二：将与miRNA-21互补配对的DNA和miRNA-21混合，混合后DNA浓度为0.01-1000nmol/L，miRNA-21浓度为0.01fmol/L-10nmol/L，混合液在15-50℃恒温培养20-240min形成DNA-RNA复合链后，加入0.01-50U/μLExoⅢ剪切酶，在15-50℃反应20-240min，得到RNA及DNA碎片，再将步骤(1)制得的Cu-CAT/GCE浸入溶液15-50℃反应20-240min，然后用二次蒸馏水淋洗，得到基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电极；步骤三：将步骤二电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，建立三电极体系传感器，置于检测液中进行微分脉冲伏安法检测，得到响应电流的数值，所述的检测液为含0.01-1000mmol/LNaCl和0.01-1000mmol/LMgCl2的磷酸盐，pH值为6.0-8.0之间的PBS缓冲溶液；步骤四：依次更换miRNA-21的浓度，重复步骤二和步骤三，测得不同miRNA-21浓度下对应的响应电流，计算出响应电流与miRNA-21浓度的线性关系。步骤五：在检测样品时，对待检测样品进行步骤二到步骤三的过程，得到对应的响应电流数值，利用步骤四所得的线性关系计算出miRNA-21浓度。进一步的，步骤二所述的DNA浓度为1～10nmol/L。进一步的，步骤二所述的ExoⅢ剪切酶加入浓度为0.1-10U/μL。进一步的，所述的响应电流为Cu-CAT还原峰电流(Ip)。进一步的，所述步骤四中，以Cu作为信号源，RNA作为目标链，在miRNA-21的浓度范围为0.01fmol/L-10nmol/L的情况下，Cu-CAT还原峰电流(Ip)与互补序列浓度对数值(lgCmiRNA-21)呈良好的线性关系。进一步的，在miRNA-21的浓度为0.01～10fmol/L时，Cu-CAT还原峰电流(Ip)值为4.202×10-5A～5.938×10-5A，线性回归方程为Ip(10-5A)＝-4.06-0.58lg(CmiRNA-21/mol/L)，相关性系数为r＝0.990；在miRNA-21的浓度为10fmol/L～10nmol/L时，Cu-CAT还原峰电流(Ip)值为3.222×10-5A～4.202×10-5A，线性回归方程为Ip(10-5A)＝1.93-0.16lg(CmiRNA-21/mol/L)，相关性系数为r＝0.997。进一步的，该检测方法的miRNA-21检测下限为0.01fmol/L。本专利技术第一次采用两步电化学沉积法在玻碳电极表面制备了电活性传感层Cu-CAT，并利用Cu-CAT与ExoⅢ酶剪切得到的寡聚核苷酸产物之间特异性的疏水性π键堆积作用，实现了HCC生物标志物的高灵敏、快速、免探针固定的传感分析。附图说明附图1为本专利反应流程示意图；附图2为实施例一中DNA与不同浓度miRNA-21(a到k分别为：0，0.01fmol/L，0.1fmol/L,1fmol/L,10fmol/L,100fmol/L,1pmol/L,10pmol/L,100pmol/L,1nmol/L,10nmol/L)杂交，并与ExoⅢ酶反应后在Cu-CAT/GCE富集50min的差分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于铜‑六羟基三亚苯的miRNA‑21电化学传感器，其为三电极体系传感器，所述的三电极中的辅助电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极为基于铜‑六羟基三亚苯的miRNA‑21电极，其特征在于：所述的基于铜‑六羟基三亚苯的miRNA‑21电极上修饰有Cu‑CAT膜，Cu‑CAT膜上吸附有ExoⅢ酶剪切DNA/miRNA‑21后的核苷酸产物。

【技术特征摘要】
1.基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器，其为三电极体系传感器，所述的三电极中的辅助电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极为基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电极，其特征在于：所述的基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电极上修饰有Cu-CAT膜，Cu-CAT膜上吸附有ExoⅢ酶剪切DNA/miRNA-21后的核苷酸产物。2.如权利要求1所述的基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器，其特征在于：以Cu作为信号源，RNA作为目标链，在miRNA-21的浓度范围为0.01fmol/L-10nmol/L的情况下，Cu-CAT还原峰电流(Ip)与互补序列浓度对数值(lgCmiRNA-21)呈良好的线性关系。3.基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器的检测方法，具体如下：步骤一：依次采用i-t法和循环伏安法在玻碳电极修饰上Cu和CAT，进而使二者反应形成Cu-CAT膜，形成Cu-CAT修饰玻璃电极；步骤二：将与miRNA-21互补配对的DNA与miRNA-21混合，培养形成DNA-RNA复合链后，加入ExoⅢ剪切酶，反应得到RNA及DNA碎片，再将步骤一制得的Cu-CAT修饰玻璃电极浸入该溶液中反应，然后用二次蒸馏水淋洗，得到基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电极；步骤三：将步骤二电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，建立三电极体系传感器，在检测液中进行微分脉冲伏安法检测，得到响应电流的数值；步骤四：更换miRNA-21的浓度，重复步骤二和步骤三，测得不同miRNA-21浓度下对应的响应电流，计算出响应电流与miRNA-21浓度的线性关系；步骤五：对待检测样进行步骤二到步骤三的过程，得到对应的响应电流数值，利用步骤四所得的线性关系计算出miRNA-21浓度。4.如权利要求3所述的基于铜-六羟基三亚苯的miRNA-21电化学传感器的检测方法，具体步骤如下：步骤一：将预处理过的玻碳电极置于Cu(NO3)2和N,N-甲基吡咯烷酮(NMP)混合液中进行i-t法扫描电沉积Cu单质膜，Cu(NO3)2的浓度为1～1000mmol/L，N,N-甲基吡咯烷酮(NMP)的浓度为1～1000mmol/L；然后将电极在CAT和NMP混合液中进行循环伏安法扫描，CAT的浓度为1-1000mmol/L，NMP的浓度为1-1000mmol/L，然后用二次蒸馏水洗涤，得到Cu-CAT修饰传感电极，记为：Cu-CAT/GCE；步骤二：将与miRNA-21互补配对的DNA和miRNA-21混合，混合后DNA浓度为0.01-1000nmol/L，miRNA-21浓度为0.01fmol/L-10nmol/L，混合液在15-50℃恒温培养20-240min形成DNA-RNA复合链后，加入0.01-...

【专利技术属性】
技术研发人员：高凤，宋娟，汪庆祥，
申请(专利权)人：闽南师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35