用于细胞侵袭、迁移能力无标记检测的太赫兹超材料芯片制造技术

本发明专利技术涉及一种用于细胞侵袭、迁移能力无标记检测的太赫兹超材料芯片，集成了细胞培养室、多孔薄膜及超材料芯片层，利用太赫兹超材料在垂直方向微米级别分布的局域增强电场，对穿过多孔薄膜的细胞数量进行原位、无标记检测，以评估细胞侵袭及迁移等运动行为。整套装置结构简单，组装便捷，体积小巧，易于整合，可重复使用。

Terahertz Metamaterial Chip for Labelless Detection of Cell Invasion and Migration Ability

The present invention relates to a terahertz supermaterial chip for unlabeled detection of cell invasion and migration ability, which integrates cell culture chamber, porous film and supermaterial chip layer. The number of cells passing through the porous film is detected in situ and unlabeled by using the local enhanced electric field distributed at micron level in the vertical direction of terahertz supermaterial in order to evaluate cell invasion and migration. Dynamic behavior. The device is simple in structure, easy to assemble, compact in size, easy to integrate and reusable.

【技术实现步骤摘要】
用于细胞侵袭、迁移能力无标记检测的太赫兹超材料芯片
本专利技术属于太赫兹测量
，涉及一种用于细胞侵袭、迁移能力无标记检测的太赫兹超材料芯片。
技术介绍
侵袭和转移是恶性肿瘤最主要的生物学特征，其表现为从肿瘤原发部位的恶性细胞脱离病灶，突破基底膜向周围间质浸润性生长，并且进入血液或淋巴液在远端器官黏附、增殖，形成肿瘤细胞转移灶；这也是导致恶性肿瘤患者死亡的重要原因。准确评价肿瘤细胞的侵袭运动能力对于肿瘤转移机制的研究和抗肿瘤药物的研发至关重要。目前体外评估细胞侵袭运动能力的实验方法主要有：1.划痕实验，其原理为获得融合紧密的单细胞层，并在单细胞层中间人为制造空白区域，称之为“划痕”，随着培养进行，划痕边缘的细胞会逐渐迁移使空白区域融合，可模拟体内细胞迁移、侵袭过程。该方法操作简便，但重复性差，且在划出痕迹过程中会导致细胞损伤、破碎，残片会阻止边缘细胞的迁移，进而影响实验结果。2.Transwell细胞实验，是目前应用广泛的方法，其依赖表面分布孔径的薄膜，统计从薄膜上层覆盖的基质(Matrigel)表面穿越转移到薄膜下层的细胞数，评估细胞的迁移能力。此方法常借助染色后光镜下随机视野计数，或者读取细胞裂解液吸光度值进行计数；但此方法操作复杂，染色耗时较长，难以满足无标记、原位高通量筛选需求。太赫兹(terahertz，THz)波在电磁波频段中处于微波和红外波之间，频率通常为0.1-10THz。太赫兹技术具备应用于细胞检测的独特优势：1THz振荡频率对应0.16皮秒转动，太赫兹技术将传统方法在飞秒尺度上检测水分子运动提升至皮秒及亚皮秒尺度，可以更为精确、实时反应胞内自由水和结合水的水化动力学。然而，传统研究细胞内水化动力学方法包括磁共振、准弹性中子散射和非相干中子散射是无法在空间上严格区分胞内水和胞外水，且需要氢氘置换或低温冷却；无法反应自然状态下细胞内部的水动力学。基于传统透射式太赫兹波谱的细胞检测受限于培养基环境强吸收干扰和检测波长与单细胞层厚度失匹配的制约，较难实现对溶液中活细胞的准确定量和定性评估。太赫兹衰减全反射技术利用太赫兹波在棱镜表面发生全反射时产生的与细胞层厚度相匹配的倏逝波进行贴壁细胞检测，是目前研究活细胞太赫兹介电特性的有效手段；但其光路搭建较为复杂，且棱镜及附属机械结构较大，较难进行微型化或芯片化以整合入现有细胞培养检测体系。太赫兹超材料传感技术为开发小型化细胞检测芯片提供新思路，其主要利用在硅、石英或其他介质膜上加工周期性排布的亚波长金属结构，形成局域表面等离子共振，以增强待检物质与太赫兹波的相互作用。太赫兹超材料具备应用于细胞无标记检测的独特优势：1.尺寸小巧，易于整合，常规厚度仅约500微米；2.检测灵敏度高，可使狭缝间隙内介质生物分子光谱吸收横截面增加103-105倍以上，吸收系数也极端增加至106-107cm-1；3.有效响应区域匹配，其表面激发局域等离子体共振的电场分布范围在数微米级别，与单个细胞厚度相匹配，可完整获得细胞的响应信息。但现有透射式太赫兹超材料的细胞检测芯片，常需要拭去细胞胞外水，且依赖于将单细胞层生长于超材料表面，只能检测静态贴壁细胞对药物诱导凋亡的响应，难以评估测量活细胞的迁移、侵袭等运动行为。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于细胞侵袭、迁移能力无标记检测的太赫兹超材料芯片。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：用于细胞侵袭、迁移能力无标记检测的太赫兹超材料芯片，包括上下设置的细胞培养室和超材料芯片层，两者均为设有一个开口的方形凹槽，它们的开口侧相对扣合构成密闭空间，在细胞培养室和超材料芯片层之间紧压一层多孔薄膜，所述多孔薄膜在密闭空间内的部分，其上表面涂布有基质层；在超材料芯片层的凹槽底部设有谐振环，谐振环的上表面粘附有细胞层。优选的，所述细胞培养室的材质为PDMS(聚二甲基硅氧烷)，多孔薄膜的材质为聚碳酸酯膜、聚四氟乙烯膜或聚酯膜，进一步优选为聚碳酸酯膜。优选的，多孔薄膜的整体尺寸与细胞培养室一致，厚度为7～11μm，孔径为8μm。优选的，所述细胞培养室与超材料芯片层紧密夹持于尼龙夹具内。优选的，所述细胞培养室与超材料芯片层的外部尺寸及凹槽尺寸均相同。优选的，所述细胞培养室设有与其内部连通的进样软管道和出样软管道。优选的，所述基质层为Matrigel基质层。优选的，所述超材料芯片层包括谐振环以及方形凹槽结构的基底两部分，所述谐振环是光刻于基底凹槽底部的周期性亚波长金属结构，基底的材质选自高阻硅或石英，谐振环的材质选自金、银、铜、铝、镍和铬。进一步优选的，所述高阻硅的厚度为500μm，电阻率大于10000Ω·cm。进一步优选的，所述谐振环分为上层和下层，它们的材质分别为金和铬。优选的，所述谐振环为周期70μm、边长66μm、金属线框宽2μm、开口缝隙宽4μm的正方形中央四开口的周期结构。进一步优选的，所述正方形中央四开口的具体结构是：在正方形每个边长的中间位置设有开口。上述太赫兹超材料芯片的制作方法，具体步骤如下：(1)将多孔薄膜在洁净的石英载玻片Ⅰ表面铺平贴紧，在洁净的石英载玻片Ⅱ上旋涂质量比5:1的聚二甲基硅氧烷和甲苯混合而成的预聚合溶液，细胞培养室的开口一侧采用微印章方法蘸取预聚合溶液，然后对准多孔薄膜后压紧，烘烤，使得细胞培养室与多孔薄膜紧密贴合，形成开口侧贴合多孔薄膜的细胞培养室；向细胞培养室内注入基质胶，在多孔薄膜的上表面形成基质层；(2)将步骤(1)所得开口侧贴合多孔薄膜的细胞培养室与超材料芯片的开口侧相对扣合压紧；(3)向细胞培养室内注入待检细胞悬液，其中的细胞沉积于基质层表面，随着培养时间的延长，细胞穿越基质层和多孔薄膜，最终粘附于周期性亚波长金属结构的上表面，形成细胞层。优选的，步骤(1)中，细胞培养室的制作方法如下：通过复制压模/成形的软刻蚀技术制备内部具有正方形凹槽的细胞培养室。进一步优选的，所述凹槽的深度为2mm。优选的，步骤(1)中，烘烤的工艺条件为：120℃烘烤1小时。优选的，步骤(2)中，超材料芯片的制作方法如下：通过深硅刻蚀的方法在基底中央区域刻蚀出一个正方形的凹槽，然后在凹槽底部镀上金属层，通过光刻技术在凹槽底部制备正方形中央四开口结构。进一步优选的，所述凹槽的深度为10μm。进一步优选的，在凹槽底部依次镀上20nm铬、180nm金。优选的，步骤(2)中，利用尼龙夹具夹持开口侧贴合多孔薄膜的细胞培养室与超材料芯片，使得两者紧密扣合。上述太赫兹超材料芯片的使用方法，使用反射式太赫兹时域光谱平台(爱德万测试，TAS7500SP)，在光路中空气湿度为3％以下时进行检测，平均2048次光谱采样并保存反射光谱信号。优选的，在注入待检细胞悬液前，先采用反射式太赫兹时域光谱平台(爱德万测试，TAS7500SP)，光路中空气湿度为3％以下，测量太赫兹超材料芯片的背景信号。本专利技术的有益效果在于：本专利技术集成了细胞培养室、多孔薄膜及超材料芯片层，利用太赫兹超材料在垂直方向微米级别分布的局域增强电场，对穿过多孔薄膜的细胞数量进行原位、无标记检测，以评估细胞侵袭及迁移等运动行为。整套装置结构简单，组装便捷，体积小巧，易于整合，可重复使用。具体如下：1、本专利技术所构建太赫兹超材料细胞芯片，利用其表面形成垂直方向分布的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于细胞侵袭、迁移能力无标记检测的太赫兹超材料芯片，其特征在于，包括上下设置的细胞培养室和超材料芯片层，两者均为设有一个开口的方形凹槽，它们的开口侧相对扣合构成密闭空间，在细胞培养室和超材料芯片层之间紧压一层多孔薄膜，所述多孔薄膜在密闭空间内的部分，其上表面涂布有基质层；在超材料芯片层的凹槽底部设有谐振环，谐振环的上表面粘附有细胞层。

【技术特征摘要】
1.用于细胞侵袭、迁移能力无标记检测的太赫兹超材料芯片，其特征在于，包括上下设置的细胞培养室和超材料芯片层，两者均为设有一个开口的方形凹槽，它们的开口侧相对扣合构成密闭空间，在细胞培养室和超材料芯片层之间紧压一层多孔薄膜，所述多孔薄膜在密闭空间内的部分，其上表面涂布有基质层；在超材料芯片层的凹槽底部设有谐振环，谐振环的上表面粘附有细胞层。2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述细胞培养室与超材料芯片层紧密夹持于尼龙夹具内。3.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述细胞培养室设有与其内部连通的进样软管道和出样软管道。4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述超材料芯片层包括谐振环以及方形凹槽结构的基底两部分，所述谐振环是光刻于基底凹槽底部的周期性亚波长金属结构。5.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述谐振环为周期70μm、边长66μm、金属线框宽2μm、开口缝隙宽4μm的正方形中央四开口的周期结构。6.权利要求1～5中任一项所述太赫兹超材料芯片的制作方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将多孔薄膜在洁净的石英载玻片Ⅰ表面铺平贴紧，在洁净的石英载玻片Ⅱ上旋涂质量比5:1的聚二甲基硅氧烷和甲苯混合而成的预聚合溶液，细胞培养室的开口一侧采用微印章方法蘸取预聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵祥，府伟灵，张立群，王云霞，熊瑜，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50