一种血浆人免疫球蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，步骤如下：（1）血浆去除冷沉淀；（2）经过DEAE Sephadex A50凝胶吸附的血浆经杂质吸附，进行Heparin亲和层析进入下一步处理；未进行DEAE Sephadex A50凝胶吸附的血浆直接进入下一步处理；（3）FI+FII+FIII沉淀，杂质吸附，复溶；（4）FII沉淀，杂质吸附，复溶；（5）复溶后FII上清经杂质吸附，层析；（6）超滤浓缩，除菌配制；（7）低pH孵育。通过本发明专利技术生产的免疫球蛋白制品，纯度≥99%，凝血因子均未检出，通过NaPTT和发色底物法检测，最终IgG制品中FXI和FXIa含量均在检测限以下。

A Method for Preparing Human Immunoglobulin in Plasma

The invention discloses a method for preparing plasma Human Immunoglobulin, and the steps are as follows: (1) plasma is used to remove cold precipitation; (2) the plasma absorbed by DEAE Sephadex A50 gel is adsorbed by impurities, and Heparin affinity chromatography is carried out for the next step; the plasma which has not been adsorbed by DEAE Sephadex A50 gel directly enters the next step; (3) FI+FII+FIII precipitation and impurity absorption. Re-dissolution; (4) FII precipitation, impurity adsorption, re-dissolution; (5) FII supernatant after re-dissolution is adsorbed by impurities, chromatography; (6) Ultrafiltration concentration, sterilization formulation; (7) incubation at low pH. The purity of the immunoglobulin product produced by the invention is more than 99%, and the coagulation factor is not detected. The content of FXI and FXIa in the final IgG product is below the detection limit by NaPTT and chromogenic substrate method.

【技术实现步骤摘要】
一种血浆人免疫球蛋白的制备方法
本专利技术涉及生物制品生产
，特别是涉及一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，具体涉及一种血浆来源的去除人凝血因子XI（FXI）及活化的人凝血因子XI（FXIa）的高安全性人免疫球蛋白的生产工艺。
技术介绍
血浆来源的人免疫球蛋白制品主要成分为免疫球蛋白G（ImmunoglobulinG，IgG），分子量150kDa，在血浆中的含量6.6~14.5g/L。其主要适应症是对抗体缺乏的补充和自身免疫疾患的免疫调节。对预防和治疗病毒和细菌感染疾病也有较好效果。人免疫球蛋白制品在根本上不同于普通药物，普通药物只有一种或几种活性，而免疫球蛋白含有多种抗体，可以通过抗体补充和对免疫系统进行调剂，对多种疾病进行特异性治疗。在药典中规定生产人免疫球蛋白，每批最少应由1000名以上健康献血员的血浆混合，其目的就是要达到广泛的抗体谱。由此可见人血浆来源的免疫球蛋白制品与现在流行的重组抗体药物有明显不同，其实现的治疗效果也是重组抗体所不能替代的。现在人血浆来源的免疫球蛋白制品主要通过低温乙醇沉淀法制备，通过多年的工艺改进，已经解决了IgA杂质、多聚体等问题。给药剂型也由原来的肌肉注射、冻干制剂改进为静脉注射、皮下给药。但是人血浆包含有复杂的成分，通过有限的纯化步骤制备的免疫球蛋白，药典规定其纯度＞95%即符合标准。剩余5%的成分虽然也是人血浆中含有的成分，但是在纯化过程中会产生某些成分的富集或变化，如包含FXI等凝血因子激活、多聚体形成，从而可能引起患者的用药不良反应。随着人免疫球蛋白制品在市场上供给量的不断增加，逐渐解决了患者原来的无药可用情况，全球使用免疫球蛋白的人均给药量也呈上升趋势。由杂质引发的严重不良反应也开始逐渐显现。2013年美国FDA的WCBP报告中汇总了从1970年以来免疫球蛋白用药相关的致栓不良反应TAE（ThromboticAdverseEvents，属于严重不良反应），尤其是2010-2012年间，Octagam、OmrIgGam（AmmannEMetal,Intravenousimmuneglobulinandthromboembolicadverseeventsinpatientswithhematologicmalignancy[J].Blood.2016Jan14;127(2):200-7.)、Vivaglobin、HepaGamB等免疫球蛋白制品在使用过程中出现的严重血栓及产品召回事件(FunkMBetal,Thromboemboliceventsassociatedwithimmunoglobulintreatment[J].VoxSang.2013Jul;105(1):54-64.）。FDA强制要求在美国上市的免疫球蛋白产品的包装盒上需在显著位置标明使用该产品有引起血栓的风险。在随后的研究中发现，免疫球蛋白制品中活化的人凝血因子XI（FXIa）是引起血栓风险的主要原因。在已报道的文献中发现FXI和FXIa可与IgG共沉淀及共纯化（BoumaBNetal,HumanbloodcoagulationfactorXI.Purification,properties,andmechanismofactivationbyactivatedfactorXII[J].BiolChem.1977Sep25;252(18):6432-7.），以现有使用最广泛的低温乙醇工艺很难完全去除IVIG制品中的FXI和FXIa。而FXI可以在多种因素下激活，甚至包括FXIa存在下的自激活（HoDHetal,Abindingsiteforheparinintheapple3domainoffactorXI[J].JBiolChem.1998Jun26;273(26):16382-90.）。因此在使用含微量FXI和FXIa的免疫球蛋白制品后，相当于增加了病人体内FXI和FXIa的水平，扰乱了病人体内的凝血因子平衡，从而增加了发生血栓的风险。国外包括Baxter及CSL等血液制品公司分别报道了其免疫球蛋白制品生产工艺中FXI和FXIa残留的研究。其中报道了辛酸-层析生产工艺中辛酸沉淀工艺可以去除制品中99.9%的FXI和FXIa，且成品中未检出FXI和FXIa（M.Komendaetal,AssessmentoftheabilityofthePrivigenpurificationprocesstodepletethrombogenicfactorXIafromplasma[J].VoxSanguinis.2014,107,26-36.）。但均未提到低温乙醇工艺详细的FXI和FXIa去除步骤。有研究表明，低温乙醇工艺生产的FII沉淀的溶解液中，FXI和FXIa的含量仍为血浆初始含量的2%，成品中FXI和FXIa的残留含量也由于批间差异，有所不同。而中国药典中低温乙醇工艺生产的免疫球蛋白成品并未对FXI和FXIa提出质量控制。因此控制并解决低温乙醇生产工艺生产的成品中FXI和FXIa残留，是免疫球蛋白生产急需关注的问题。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述存在的缺陷而提供一种血浆人免疫球蛋白的制备方法。通过本专利技术生产的免疫球蛋白制品，纯度≥99%，凝血因子均未检出，使用Heparin亲和层析可能产生的Heparin配基脱落也未检出。通过NaPTT和发色底物法检测，最终IgG制品中FXI和FXIa含量均在检测限以下，判定为未检出。本专利技术的一种血浆人免疫球蛋白的制备方法技术方案为，一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，采用的方法步骤如下：（1）血浆去除冷沉淀；（2）经过DEAESephadexA50凝胶吸附的血浆经杂质吸附，进行Heparin亲和层析进入下一步处理；未进行SephadexA50凝胶吸附的血浆直接进入下一步处理；（3）FI+FII+FIII沉淀，杂质吸附，复溶；（4）FII沉淀，杂质吸附，复溶；（5）复溶后FII上清经杂质吸附，层析；（6）超滤浓缩，除菌配制；（7）低pH孵育。步骤（2）具体为：去除冷沉淀的血浆，如果进行人凝血酶原复合物（PCC）的生产，需进行DEAESephadexA50凝胶吸附；DEAESephadexA50凝胶吸附后的血浆经过杂质吸附及0.2μm的滤芯过滤后进行Heparin亲和层析，收集流穿和洗涤的血浆，进行下一步处理。如果去除冷沉淀的血浆不需进行DEAESephadexA50凝胶吸附，因凝血因子II、VII、IX、X未去除，进行杂质吸附时会导致因子激活，产生血浆凝固风险，达不到层析过滤精度血浆则不能进行Heparin亲和层析。因此去除冷沉淀的血浆直接进行后续低温乙醇沉淀工艺步骤处理。步骤（2）中的杂质吸附，采用带强阳离子电荷,如ZetaPlusZB系列（30~120）的吸附材质；使用注射用水对吸附材质进行清洗，再用含100~200mNaCl，10~50mMNa2HPO4，pH6.5~7.5的溶液对吸附材质进行清洗，用量为50~150L/m2；冲洗完成后排干设备内的溶液并用压缩空气吹干吸附材质，用于杂质吸附。步骤（2）中，所述Heparin亲和层析，通过装填有Heparin配基的亲和凝胶的层析柱进行固定床亲和层析，杂质吸附后的血浆通过0.2μm的滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，采用的方法步骤如下：（1）血浆去除冷沉淀；（2）经过DEAE Sephadex A50凝胶吸附的血浆经杂质吸附，进行Heparin亲和层析进入下一步处理；未进行DEAE Sephadex A50凝胶吸附的血浆直接进入下一步处理；（3）FI+FII+FIII沉淀，杂质吸附，复溶；（4）FII沉淀，杂质吸附，复溶；（5）复溶后FII上清经杂质吸附，层析；（6）超滤浓缩，除菌配制；（7）低pH孵育。

【技术特征摘要】
1.一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，采用的方法步骤如下：（1）血浆去除冷沉淀；（2）经过DEAESephadexA50凝胶吸附的血浆经杂质吸附，进行Heparin亲和层析进入下一步处理；未进行DEAESephadexA50凝胶吸附的血浆直接进入下一步处理；（3）FI+FII+FIII沉淀，杂质吸附，复溶；（4）FII沉淀，杂质吸附，复溶；（5）复溶后FII上清经杂质吸附，层析；（6）超滤浓缩，除菌配制；（7）低pH孵育。2.根据权利要求1所述的一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）具体为：去除冷沉淀的血浆，如果进行人凝血酶原复合物（PCC）的生产，需进行DEAESephadexA50凝胶吸附；DEAESephadexA50凝胶吸附后的血浆经过杂质吸附后进行Heparin亲和层析，收集流穿和洗涤的血浆，进行下一步处理。3.根据权利要求1所述的一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的杂质吸附，采用带强阳离子电荷,如ZetaPlusZB系列（30~120）的吸附材质；使用注射用水对吸附材质进行清洗，再用含100~200mNaCl，10~50mMNa2HPO4，pH6.5~7.5的溶液对吸附材质进行清洗，用量为50~150L/m2；冲洗完成后排干设备内的溶液并用压缩空气吹干，用于杂质吸附。4.根据权利要求1所述的一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述Heparin亲和层析，通过装填有Heparin配基的亲和凝胶的层析柱进行固定床亲和层析，杂质吸附后的血浆通过0.2μm的滤芯过滤上样，上样完成后再用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净；收集流穿液和洗涤液进入下一步人免疫球蛋白的生产；每次上样量为20~30个柱床体积；所述的平衡液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠0.3~0.6mol/L，pH6.50~7.50；所述的洗脱液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠1.5~2.5mol/L，pH6.50~7.50；平衡、上样和洗脱线流速60cm/h~300cm/h；柱再生：分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理；柱保存：20%乙醇溶液保存。5.根据权利要求4所述的一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述Heparin配基的亲和凝胶，为CaptoHeparin、HeparinSepharoseFastflow、TOYOPEARLAF-HeparinHC-650F中的一种。6.根据权利要求1所述的一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（5）中的杂质吸附，采用带强阳离子电荷,如ZetaPlusZB系列（30~120）的吸附材质；使用注射用水对吸附材质进行清洗，再用含5~15mMNa2HPO4，pH6.5~7.5的溶液对吸附材质进行清洗，用量为50~150L/m2；冲洗完成后排干设备内的溶液并用压缩空气吹干吸附材质，用于杂质吸附。7.根据权利要求1所述的一种血浆人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：周安，菅长永，马山，
申请(专利权)人：山东泰邦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37