一种肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂的制备方法，属于纳米材料和生物工程技术领域。该方法采用改进的共沉淀法，在氮气保护下制备出琥珀酰超低分子量肝素包覆的水溶性超小四氧化三铁纳米粒子，得到的纳米粒子核平均粒径是2nm，聚合物涂层厚度为1.0nm‑2nm。琥珀酰低分子量肝素上大量的羧基不但能够使氧化铁纳米粒子稳定地分散于去离子水中，而且能够与靶向分子结合，赋予该纳米材料磁性和叶酸双重靶向功能。本发明专利技术所合成的具有磁性和叶酸双重靶向复合磁性纳米粒子形貌均一，分散性好，而且生物相容性好，T1弛豫率高，在小鼠体内血液半衰期短，48小时内基本完全排除体外，在不影响小鼠正常生理活动的情况下实现精准靶向肿瘤T1和T2磁共振成像。作为磁共振造影剂，该方法制备出的超小双靶向双模态磁性纳米粒子在磁共振成像、癌症早期诊断、影像跟踪疗效评估等生物医学领域具有广泛的应用前景。

Preparation of a Kidney Clearance Ultra-small Dual Target Dual-mode Magnetic Resonance Contrast Agent

The invention discloses a preparation method of ultra-small dual-target dual-mode magnetic resonance contrast agent for kidney clearance, which belongs to the field of nanomaterials and Bioengineering technology. In this method, water-soluble ultra-small ferric oxide nanoparticles coated with succinyl ultra-low molecular weight heparin were prepared by an improved coprecipitation method under nitrogen protection. The average particle size of the nanoparticles was 2 nm, and the thickness of the polymer coating was 1.0 nm to 2 nm. A large number of carboxyl groups on succinyl low molecular weight heparin can not only stabilize the dispersion of iron oxide nanoparticles in deionized water, but also bind to target molecules, giving the nanomaterials dual targeting function of magnetic and folic acid. The synthesized magnetic nanoparticles with magnetic and folic acid dual targeting have uniform morphology, good dispersion, good biocompatibility, high T1 relaxation rate, short half-life of blood in mice, and can be completely excluded in vitro within 48 hours, thus achieving precise targeting of tumor T1 and T2 magnetic resonance imaging without affecting normal physiological activities of mice. As a magnetic resonance contrast agent, the ultra-small dual-target dual-mode magnetic nanoparticles prepared by this method have broad application prospects in the fields of magnetic resonance imaging, early diagnosis of cancer, evaluation of therapeutic effect of image tracking and other biomedical fields.

【技术实现步骤摘要】
一种肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂的制备方法
本专利技术属于纳米材料和生物工程
，具体涉及一种超小双靶向双模态磁共振造影剂的制备方法，属于生物医学领域。
技术介绍
作为医学研究和临床诊断中有效的成像工具，人们对磁共振成像(MRI)进行了深入研究。MRI可效检测组织坏死、局部缺血和各种恶性病变(如肿瘤)，并能进行早期诊断，还能对器官移植等进行监测。但是正常组织和病变组织在弛豫时间上仅表现出微小差异，会降低诊断的特异性与敏感性，单纯根据图像进行诊断未必能得到准确的结果，因此大约有30％的临床扫描成像采用造影剂来增强图像的对比度。MRI造影剂主要分为T1(阳性)造影剂或T2(阴性)造影剂两类。但是放射科医生强烈偏好T1造影剂，因为T2造影剂的成像显示为黑暗区域，这很难区分内部出血，空气-组织边界，或其他伪影，导致对患者诊断的不太准确。目前，临床上最常用的T1造影剂是能从体内快速排出的基于钆(Gd3+)的螯合物(GBCAs)，但而GBCA仍有较大的不良风险影响包括肾性系统性纤维化和人脑中的Gd沉积。我们发现常用做T2造影剂的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPINOs)不仅具有良好的生物相容性和低毒性，而且在小尺寸时由于其较大的表面积和5个不成对电子增强的T1效应而成为是T1造影剂潜在候选者。值得注意的是，随着氧化铁纳米粒子粒径的减小，其表面积显著增大，磁性迅速减小，进而使其T1效应增强。而目前来说，先进造影剂不仅能进行MRI成像，而且能从体内排出。由文献可知，从肝脏排泄时对药物的平均保留时间比从肾排出长得多，使健康风险增加，所以，从肾脏排出是优先选择。当水合动力学尺寸小于肾小球的过滤尺寸6nm-8nm时，纳米粒子能从肾脏快速排出，减少其在体内的积累和对身体的危害。因此，如果能制备出一种出具有良好生物相容性，r1值高、成像效果好，并且能从体内快速排出的T1MRI造影剂将进一步拓展其在磁共振中的应用。肝素(Heparin)是一种天然生物活性多糖类化合物，由硫酸-D-葡萄糖胺、硫酸-D-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸中两种双糖单位交替连接而成。作为生物制品的肝素具有以下优点：(1)良好的水溶性；(2)良好的生物相容性，是获得美国食品药品管理局(FDA)认证的最有效、使用最广泛的抗凝血药物之一；(3)生物降解性且降解产物对人体无害；(4)有与多种生长因子结合的位点，能够促进生长因子对细胞增殖、组织或器官修复和再生的作用。因此，肝素功能化生物材料近年来受到广泛关注。由文献可知，聚合物改性后的纳米粒子总尺寸与聚合物的分子量有关，且羧基对氧化铁纳米粒子表面的结合能力较强，因此，琥珀酰超低分子量肝素不仅能提供纳米颗粒较小的水合动力学粒径和胶体稳定性，为纳米颗粒能从肾脏排出提供了可能，还能使纳米颗粒表面带有竣基官能团，为纳米颗粒的表面多功能修饰提供了可行性。当表面连接靶向分子-叶酸后，赋予了本身具有磁靶向性的超小氧化铁纳米粒肿瘤靶向性。总之，本专利技术提供了一种肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂，既具磁靶向和肿瘤靶向功能，又能在低浓度时进行T1磁共振成像，高浓度时进行T2共振成像，而且还能通过肾脏快速排出体外，减少纳米粒子在体内的积累和对身体的危害。而且这种造影剂物具有无毒性、肿瘤靶向性好、特异性强、用量少、体内稳定性高等特点，特别适用于黑色素肿瘤等恶性肿瘤组织的靶向诊断。
技术实现思路
：本专利技术拟解决的技术问题是提供一种超小双靶向双模态磁共振造影剂的制备方法，首先采用一步法制备出表面包覆琥珀酰超低分子量肝素的超小氧化铁纳米粒子，并在其表面连接靶向分子，赋予该纳米粒子双重靶向性：磁靶向和肿瘤靶向。本专利技术产品采用的琥珀酰超低分子量肝素具有较好的亲水性和生物相容性等优异性能，可以在对纳米粒子粒径影响较小的情况下，有效提高氧化铁纳米粒子的水溶性、分散性、稳定性和生物相容性。本专利技术产品由如下步骤制备：1.琥珀酰超低分子量肝素的制备：0.1g-10.0g的低分子量肝素钠溶解在10mL-100mL醋酸溶液中，并向该溶液加入1mL-50mL亚硝酸钠溶液，反应在室温下进行0.5h-5h后，用氢氧化钠溶液将该溶液的pH值调至6.0-7.0，将该溶液冷冻干燥，得到0.1g-10.0g的超低分子量肝素钠。将0.1g-1.0g超低分子量肝素钠溶解在10mL-50mL水中，并将该溶液渗透通过50mL-200mL酸化过的凝胶柱，之后用三正丁胺溶液将溶液的pH调至6.0-7.0，将该溶液冷冻干燥，得到0.1g-10.0g超低分子量肝素三丁基铵盐。将0.1g-10.0g超低分子量肝素三丁基铵盐溶解在10mL-500mL的干燥溶剂N，N二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气下保护下，将5.0g-50.0g琥珀酸酐和0.1g-10.0g4-二甲基氨基嘌呤(DMAP)依次加入反应液，反应在室温下进行24h-72h后，将过量的溶剂蒸发掉，用适量的去离子水稀释后，将该溶液渗透通过50mL-200mL酸化过的凝胶柱，之后用三丁胺溶液将溶液的pH调至6.0-7.0，将该溶液冷冻干燥，得到0.1g-15.0g琥珀酰超低分子量肝素三丁基铵盐；2.超小水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：将1.0mg-800.0mg(1)步骤制备的超低分子量琥珀酰肝素三丁基铵盐溶于1.0mL-50.0mL去离子水中，待其完全溶解，向溶液中一次加入1.0mg-100.0mg六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)和1.0mg-100.0mg四水合二氯化铁(FeCl2·4H2O)，并在氮气保护下将氨水(NH3·H2O)加入该溶液中至溶液pH为9.0-11.0，将该溶液升温至50℃-100℃，并在该温度下搅拌30min-90min后，将该溶液用分子量为1000-5000的透析袋在pH＝1.0-5.0的水溶液中透析1d-4d。最后，将该超小水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子保持于去离子水中，待用。3.水溶性氨基叶酸的制备：参照文献[LeeES，，etal.″PolymericmicellefortumorpHandfolate-mediatedtargeting.″JournalofControlledRelease，2003，91(1)：103-113.]。4.双靶向超小水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：向1.0mL-20.0mL(2)步骤制备的超小水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子水溶液加入1.0mg-100.0mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1.0mg-100.0mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)，1℃～10℃下进行活化1h～5h后，将0.1mg-10.0mg氨基叶酸加入该溶液中，室温下反应12h～36h，用分子量为1000-5000的透析袋在水溶液中透析1d-7d。最后，形成的双靶向超小水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子保持于去离子水中，待用。所述步骤1中醋酸溶液的浓度为10mmol/L-200mmol/L。所述步骤1中亚硝酸钠溶液的浓度为1mmol/L-100mmol/L。所述步骤1中醋酸溶液与亚硝酸钠溶液的体积比为1∶1-10∶1。所述步骤1制备得到的琥珀酰超低分子量肝素三丁基铵盐的分子量为1000～10000。所述步骤1制备得到的琥珀酰超低分子量肝素三丁基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂，其特征在于该造影剂是以超顺磁性四氧化三铁纳米为核心，表面均匀地修饰有琥珀酰肝素，且偶联靶向分子。

【技术特征摘要】
1.一种肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂，其特征在于该造影剂是以超顺磁性四氧化三铁纳米为核心，表面均匀地修饰有琥珀酰肝素，且偶联靶向分子。2.如权利要求1所述的肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂，其特征在于所述超顺磁性四氧化三铁纳米的平均粒径为2nm。3.如权利要求1所述的肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂，其特征在于所述琥珀酰超低分子量肝素的厚度为1.0nm-2nm。4.如权利要求1所述的肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂，其特征在于所述靶向分子为叶酸。5.一种肾脏清除的超小双靶向双模态磁共振造影剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)琥珀酰超低分子量肝素的制备：0.1g-10.0g的低分子量肝素钠溶解在10mL-100mL醋酸溶液中，并向该溶液加入1mL-50mL亚硝酸钠溶液，反应在室温下进行0.5h-5h后，用氢氧化钠溶液将该溶液的pH值调至6.0-7.0，将该溶液冷冻干燥，得到0.1g-10.0g的超低分子量肝素钠。将0.1g-1.0g超低分子量肝素钠溶解在10mL-50mL水中，并将该溶液渗透通过50mL-200mL酸化过的凝胶柱，之后用三正丁胺溶液将溶液的pH调至6.0-7.0，将该溶液冷冻干燥，得到0.1g-10.0g超低分子量肝素三丁基铵盐。将0.1g-10.0g超低分子量肝素三丁基铵盐溶解在10mL-500mL的干燥溶剂N，N二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气下保护下，将5.0g-50.0g琥珀酸酐和0.1g-10.0g4-二甲基氨基嘌呤(DMAP)依次加入反应液，反应在室温下进行24h-72h后，将过量的溶剂蒸发掉，用适量的去离子水稀释后，将该溶液渗透通过50mL-200mL酸化过的凝胶柱，之后用三丁胺溶液将溶液的pH调至6.0-7.0，将该溶液冷冻干燥，得到0.1g-15.0g琥珀酰超低分子量肝素三丁基铵盐；(2)超小水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：将1.0mg-800.0mg(1)步骤制备的超低分子量琥珀酰肝素三丁基铵盐溶于1.0mL-50.0mL去离子水中，待其完全溶解，向溶液中一次加入1.0mg-100.0mg六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)和1.0mg-100.0mg四水合二氯化铁(FeCl2·4H2O)，并在氮气保护下将氨水(NH3·H2O)加入该溶液中至溶液pH为9.0-11.0，将该溶液升温至50℃-100℃，并在该温度下搅拌30min-90min后，将该溶液用分子量为1000-5000的透析袋在pH＝1.0-5.0的水溶液中透析1d-4d。最后，将该超小水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子保持于去离子水中，待用。(3)水溶性氨基叶酸的制备：将0.1g-10.0g叶酸加入到10.0mL-50.0mL的无水二甲基亚砜(DMSO)中，室温下搅拌至叶酸溶解完全，并将溶解了0.1g-10.0g二环己基碳二亚胺(DCC)和0.1g-10.0gN-羟基丁二酰亚胺(NHS)的10...

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅庆，谢曼曼，卢乾，张旭东，王子阳，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32