一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法技术

本发明专利技术公开了一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法，包括以下步骤：(1)干细胞在含有示踪剂的培养基中孵化，将已标记的干细胞置于恢复液中恢复后，用胰蛋白酶处理，再分散并在新鲜培养基中计数，标记的干细胞被收集起来并在2小时内植入体内；(2)用核磁共振成像仪示踪监测植入体内的干细胞在体内的情况，并储存用于图像分析。用微粒标记干细胞，运用磁共振和光声成像在体外和在大鼠肩袖伤模型中长时间示踪肌腱干细胞，展示了MRI和PA双模态示踪肌腱干细胞及应用肌腱干细胞治疗大鼠肩袖损伤的广阔前景。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法
本专利技术属于生物医学
，涉及一种示踪方法，尤其涉及一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法。
技术介绍
肌腱损伤是一种常见的疾病，多表现为人的肩袖、跟腱、伸肌总腱损伤。忽略症状，在普通人中肩袖撕裂伤事故大约占比20％，但接近50％的个体是年逾80岁的老人。然而，肌腱修复在运动医学和骨科实践中仍是一个极大的挑战。间质干细胞(MSCs)、脂肪干细胞(ADSCs)和肌腱干细胞(TSCs)被用于促进肩袖损伤的修复。为了监测和优化在临床前期研究中用于修复肩袖肌腱损伤的干细胞的疗效，追踪移植的干细胞是非常重要的，这样才能提高干细胞治疗的临床应用。近年来，基于细胞成像的细胞追踪技术越来越受到关注，它能够在细胞移植后体内局部，在生物进程中更好地弄清生物进程中细胞的结局。各种成像方式包括：磁共振成像、光学成像、辐射成像、光声成像等等已经被用于细胞追踪。但是所有独立的成像方式都有其局限性。举例来说，光学成像的局限为其较浅的渗透深度和光毒性，磁共振的敏感性低，辐射成像的缺点是有细胞毒性、时间跨度短和空间分辨率低。所以同时联合双模或者多种模式成像方式力量的方法被呼吁应用，以达到满足要求的细胞跟踪规范。
技术实现思路
针对独立成像方式的局限性，本专利技术提供了一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法，用负载氧化铁的聚乙乳酸羟基乙酸(PLGA/IO)微粒标记干细胞，运用磁共振和光声成像在大鼠肩袖伤模型中长时间追踪肌腱干细胞，展示了模型中治疗肌腱损伤的广阔前景。本专利技术采用的技术方案是：一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法，包括以下步骤：(1)标记干细胞干细胞在含有示踪剂的培养基中孵化，将已标记的干细胞置于恢复液中恢复后，用胰蛋白酶处理，再分散并在新鲜培养基中计数，标记的干细胞被收集起来并在2小时内植入体内；(2)MR/PA示踪用核磁共振成像仪示踪监测植入体内的干细胞在体内的情况；在相同的每一个时间点，同时用光声成像系统获得光声成像的图形，并储存用于图像分析。本专利技术所述的示踪剂为负载氧化铁的聚乙乳酸羟基乙酸微粒(PLGA/IOMPs)。PLGA/IOMPs是一种对TSCs细胞毒性作用小、能同时进行PA和MRI显像的多功能对比剂。氧化铁纳米粒具有良好的生物相容性和独特的磁性，是常用的MRI阴性对比剂；同时该粒子又可以作为一种外源性的光敏剂被引入生物组织内，通过改变组织局部的声学和光学特性而提高组织成像的分辨率和对比度。因此，氧化铁纳米粒可以行PA/MRI成像。而PLGA是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有无毒、生物相容性好的特点，并作为成膜材料被广泛应用于超声分子微泡和纳米粒的制备中。将氧化铁纳米粒包裹入PLGA中形成微米级粒子更容易使其内化，提高细胞标记率。PLGA/IOMPs在T2WIMRI图像中呈低信号，起标记的干细胞亦呈低信号，而损伤肩袖则呈高信号，二者形成良好的对比，很容易鉴别出标记干细胞，从而达到MRI体内示踪肌腱干细胞的目的。本专利技术中损伤肩袖因为外科手术的操作导致纤维断裂和水肿，PA成像上几乎不表象出红色的光声信号，而PLGA/IOMPs及其标记的TSCs则表现出红色光声信号，二者形成强烈反差，便于我们从损伤肩袖出探查到表现为红色光声信号的标记TSCs，从而达到PA成像体内示踪TSCS的目的。优选地，将培养基置于含Fe100ug/ml的示踪剂溶液中。在该浓度下标记TSCs的体外PA/MRI成像呈现出较强的信号强度，便于鉴别。优选地，所述微粒的的粒径为600-1000nm。微米级粒子相比纳米粒子更容易细胞内化、提高细胞标记率，使得成像效果更好，利于干细胞的体内外示踪。优选地，在标记前，所述示踪剂在室温下的磷酸盐缓冲液中用0.01％的多聚赖氨酸孵化40分钟。粒子的阳性表面电荷会促使粒子被吞噬进入细胞内，从而提高细胞标记率；本专利技术中PLGA/IOMPs与0.01％的多聚赖氨酸孵化后粒子的表面电荷由负变为正，但其本身性质没有发生变化，从而达到提高TSCs对该粒子的摄取率。本专利技术所述的恢复液中含质量浓度为10％的牛胎血清、1％的左旋谷酰胺和1％的盘尼西林(链霉素)。该恢复液特定地应用于标记TSCs，添加了左旋谷酰胺，能给细胞提供能量来源，参与蛋白质合成和核酸代谢，有利于标记TSCs的生长和增殖。本专利技术所述的光声成像采用700纳米的波长辐照进行PA成像。于该波长时进行的PA成像，其成像效果最好，PA信号强度最强。本专利技术通过MRI/PA双模态成像分别在体外通过PLGA/IOMPs追踪肌腱干细胞21天和14天，在大鼠肩袖伤模型中分别追踪21天和7天，证明了用标记的肌腱干细胞治疗肌腱损伤能得到更高程度的恢复。不论是在体外还是在大鼠肩袖损伤模型中都能通过双模态的MR/PA成像长时间追踪用PLGA/IOMPs标记的肌腱干细胞，也能通过注射标记肌腱干细胞来提高肌腱的结构和生物力学性能。附图说明图1为PLGA/IO微粒体外示踪TSCs的效率。(A)不同时间点TSCs的MRI图像；(B)不同时间点TSCs的PA图像；(C)不同时间点TSCs的MR信号强度分析；(D)不同时间点TSCs的PA信号强度分析；(E)TSCs细胞内Fe含量的变化。图2为标记TSCs和非标记TSCs的细胞增殖情况。图3为TSCs移植到大鼠肩袖损伤模型后的MR和PA图像。(A)MRI观察移植后3(A1)、7(A2)、14(A3)、21(A4)、28(A5)天和35天(A6)大鼠肩袖；(B)PA观察移植后3(B1)、7(B2)、14(B3)、21(B4)、28天(B5)和35天(B6)大鼠肩袖。图4为HE显示TSCs能促进大鼠肩袖损伤修复。图5为生物力学测试显示TSCs治疗能有效提高大鼠肩袖最大抗拉力强度。具体实施方式为了更加清楚、详细地说明本专利技术的目的技术方案，下面通过相关实施例对本专利技术进行进一步描述。以下实施例仅为具体说明本专利技术的实施方法，并不限定本专利技术的保护范围。实施例1一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法，包括以下步骤：(1)标记干细胞干细胞在含有示踪剂的培养基中孵化，将已标记的干细胞置于恢复液中恢复后，用胰蛋白酶处理，再分散并在新鲜培养基中计数，标记的干细胞被收集起来并在2小时内植入体内；(2)MR/PA示踪用核磁共振成像仪示踪监测植入体内的干细胞在体内的情况，同时用光声成像系统获得光声成像的图形，并储存用于图像分析。实施例2在实施例1的基础上：所述的示踪剂为负载氧化铁的聚乙乳酸羟基乙酸微粒。将培养基置于含Fe100ug/ml的示踪剂溶液中。所述微粒的粒径为700nm。实施例3在实施例1的基础上：所述的示踪剂为负载氧化铁的聚乙乳酸羟基乙酸微粒。将培养基置于含Fe100ug/ml的示踪剂溶液中。所述微粒的粒径为900nm。实施例4在实施例1的基础上：所述的示踪剂为负载氧化铁的聚乙乳酸羟基乙酸微粒。将培养基置于含Fe100ug/ml的示踪剂溶液中。所述微粒的粒径为800nm。实施例5在实施例1的基础上：所述的示踪剂为负载氧化铁的聚乙乳酸羟基乙酸微粒。将培养基置于含Fe100ug/ml的示踪剂溶液中。所述微粒的粒径为650nm。在标记前，所述示踪剂在室温下的磷酸盐缓冲液中用0.01％的多聚赖氨酸孵化40分钟。实施例6在实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)标记干细胞干细胞在含有示踪剂的培养基中孵化，将已标记的干细胞置于恢复液中恢复后，用胰蛋白酶处理，再分散并在新鲜培养基中计数，标记的干细胞被收集起来并在2小时内植入体内；(2)MR/PA示踪用核磁共振成像仪示踪监测植入体内的干细胞在体内的情况，同时用光声成像系统获得光声成像的图形，并储存用于图像分析。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)标记干细胞干细胞在含有示踪剂的培养基中孵化，将已标记的干细胞置于恢复液中恢复后，用胰蛋白酶处理，再分散并在新鲜培养基中计数，标记的干细胞被收集起来并在2小时内植入体内；(2)MR/PA示踪用核磁共振成像仪示踪监测植入体内的干细胞在体内的情况，同时用光声成像系统获得光声成像的图形，并储存用于图像分析。2.根据权利要求1所述的干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法，其特征在于，所述的示踪剂为负载氧化铁的聚乙乳酸羟基乙酸微粒。3.根据权利要求2所述的干细胞的磁共振和光声双模态示踪方法，其特征在于，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢漫，成雪晴，王志刚，蒋京真，张振奇，
申请(专利权)人：四川省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：四川,51