一种圆褐固氮菌及其鉴定方法和应用技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域的一种圆褐固氮菌及其鉴定方法和应用。该圆褐固氮菌16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示，菌株为SINOPEC12，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M2016110。该菌株在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关，可用作油气微生物，指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。同时，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，无需扩增培养，通过改进的引物即可对土壤中的圆褐固氮菌SINOPEC12的16S rDNA保守序列进行扩增，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度，解决了传统生理生化检测周期长，对样品培养物纯度要求高的不足。

A Round Brown Nitrogen Fixing Bacteria and Its Identification Method and Application

The invention relates to a round brown nitrogen fixing bacteria in the field of microbial technology and its identification method and application. The 16S rDNA gene sequence of the Azotobacter rotundifolia is shown by SEQ ID NO.1. The strain is SINOPEC12, and the preservation number of CCTCC NO:M2016110 is the Preservation Center of typical culture in China. The abundance of the strain in the soil above the reservoir is positively correlated with the concentration of floating gaseous hydrocarbons in the reservoir. It can be used as an oil and gas microorganism to indicate the high value area of hydrocarbon leakage above the reservoir. At the same time, the strain is abundant in the soil above the oil and gas reservoir. Without amplification and culture, the 16S rDNA conservative sequence of the Azotobacter SINOPEC12 in the soil can be amplified by improved primers, which can accurately and efficiently judge the concentration of floating gaseous hydrocarbons in the oil and gas reservoir, and overcome the shortcomings of long period of traditional physiological and biochemical detection and high requirement for the purity of sample culture.

【技术实现步骤摘要】
一种圆褐固氮菌及其鉴定方法和应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种圆褐固氮菌及其鉴定方法和应用。
技术介绍
微生物勘探技术的核心是油气指示微生物的鉴定。通常情况下勘探过程中所研究的目标微生物在环境中的相对丰度很低，因此需在传统的特异培养条件下刺激油气藏环境与非油气藏环境中烃类氧化细菌的快速繁殖。上述方法虽然可以获得微生物的数量信息，但是该数量信息事实上成几何倍数地高于原位环境中的微生物数量，不可避免地掩盖了油气藏与非油气藏环境中微生物数量上的差异，同时也无法获得不可培养微生物的信息。另外，油气微生物的生长除受烃类影响，还会受到周围环境的影响，如土壤的湿度、pH值、盐度或其中的关键离子、营养物质和扰动等。若微生物发育的相对强弱是由环境因素所引起，则会造成油气富集或贫乏的假象。圆褐固氮菌属于细菌，菌体杆状、卵圆形或球形，无内生芽孢，革兰氏染色阴性，严格好氧、有机营养型，能固定空气中的氮素。包括固氮菌属、氮单孢菌属、拜耶林克氏菌属和德克斯氏菌属。在普光气田油气藏上方土壤中发现该菌占较大的丰度，为了进一步确定该菌与油气微生物勘探之间的关系，需对其典型菌株的获取及检测技术进行开发研究。目前，圆褐固氮菌的常见检测鉴定方法有两种：1.生理生化鉴定，通过分离出的纯菌，对微生物生理生化进行定性研究，该方法周期长且对培养物纯度提出较高的要求；2.基因提取后进行16SrDNA的测序，该方法仍需获取纯培养物进行全基因提取，再通过通用16SrDNA引物获取保守序列进行测序。因此，为了能够快速、准确获取油气田上方土壤中圆褐固氮菌的特征信息，急需对其典型菌株的获取及混合体系中的检测技术进行开发研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了一种圆褐固氮菌及其鉴定方法，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，且所述圆褐固氮菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关，因此该菌株可用作油气微生物，指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。本专利技术还提供了一种利用所述圆褐固氮菌指示油气藏上浮气态烃浓度的方法，该方法采用改进的引物对所述圆褐固氮菌的16SrDNA保守序列进行扩增，根据扩增产物中目标条带的亮度，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度。为此，本专利技术第一方面提供了一种圆褐固氮菌，其16SrDNA的基因序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术，所述圆褐固氮菌的菌株为SINOPEC12，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNO：M2016110。根据本专利技术，所述圆褐固氮菌的生物学特征为：在固体培养基上的菌落呈圆形、半透明、表面光滑、中间凸起、粘稠状，显微镜下的细胞形态呈杆状、周生鞭毛、有荚膜，革兰氏染色反应呈阴性。本专利技术中，所述的固体培养基为甲醇固体培养基或丁醇固体培养基；具体地，所述的甲醇固体培养基的组成如下(1L去离子水中)：和/或，所述的丁醇固体培养基的组成如下(1L去离子水中)：本专利技术中，所述甲醇固体培养基和乙醇固体培养基的pH值均为7-8；优选地，所述甲醇固体培养基和乙醇固体培养基的pH值均为7。根据本专利技术，所述圆褐固氮菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关。本专利技术第二方面提供了一种如本专利技术第一方面所述圆褐固氮菌的鉴定方法，其包括对待测菌株进行16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列测序，并且所述待测菌株的16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列与如SEQIDNO.1的序列的一致性在95％以上，优选所述待测菌株的16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列与如SEQIDNO.1的序列的一致性在97％以上，更优选所述待测菌株的16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列与如SEQIDNO.1的序列的一致性在99％以上，最优选所述待测菌株的16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列与如SEQIDNO.1的序列的一致性在99.5％以上，则鉴定所述待测菌株为所述圆褐固氮菌。本专利技术中，使用如SEQIDNO:2(5’-AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGG-3’)和SEQIDNO:3(5’-CAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCAC-3’)作为引物对，进行PCR扩增以获得的所述16SrDNA的部分序列，并将所述16SrDNA的部分序列进行测序来与如SEQIDNO:1的相应序列比较以鉴定所述待测菌株。在本专利技术的另一些实施方式中，所述方法还包括结合将待测菌株的生物学特性与本专利技术第一方面所述圆褐固氮菌的生物学特性的比较以对所述待测菌株进行鉴定。具体地，所述的生物学特性为：菌落在固体培养基上呈圆形、半透明、表面光滑、中间凸起、粘稠状，显微镜下细胞形态呈杆状、周生鞭毛、有荚膜，革兰氏染色反应呈阴性。所述的固体培养基为甲醇固体培养基或丁醇固体培养基；所述固体培养基的pH值为7-8。一般来讲，利用微生物的16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列对微生物进行鉴定具有例如如下优点：对未知样品进行快速种属分析；为生化鉴定提供指导信息；对于难以获得纯培养的细菌，如寄生菌等，使用16SrDNA鉴定是唯一可用的鉴定手段。但是有的微生物由于种间差异小，单独依靠16SrDNA鉴定不能鉴定到种。需要其它鉴定方法补充，例如微生物的生物学特性。本专利技术第三方面提供了一种如第一方面所述的圆褐固氮菌在指示油气藏上浮气态烃浓度中的应用。根据本专利技术，所述的应用具体包括以下步骤：A，提取油气藏上方土壤中微生物的全基因组，获得用于PCR扩增的模板；B，设计引物对模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；C，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带的亮度，判断油气藏上浮气态烃的浓度；具体地，目标条带的亮度越强，油气藏上浮气态烃的浓度越高。在本专利技术的一些实施方式中，所述引物为：上游引物：5’-AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGG-3’(SEQIDNO:2)；下游引物：5’-CAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCAC-3’(SEQIDNO:3)。本专利技术中，用语“油气藏上方土壤”的含义为：油气藏中油气高丰度范围的垂直上方近地表1米内的土壤。本专利技术的有益效果为：本专利技术从典型油气藏上方土壤中筛选到一株圆褐固氮菌SINOPEC12，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关，可用作油气微生物，指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。同时，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，无需扩增培养，通过改进的引物即可对土壤中的圆褐固氮菌SINOPEC12的16SrDNA保守序列进行扩增，根据扩增产物中目标条带的亮度，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度，解决了传统生理生化检测周期长，对样品培养物纯度要求高的不足。另外，该菌株可在污染的环境中存活，作为生物去污的接种介体。附图说明下面将结合附图来说明本专利技术。图1显示了本专利技术的圆褐固氮菌SINOPEC12基于16SrDNA的系统发育树。图2为实施例1中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图中附图标记的含义如下：MMarker；1第1泳道；2第2泳道；3第3泳道。菌种保藏分类命名：圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)；菌株编号：SINOPEC12保藏机构：中国典型培养物保藏中心保藏机构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种圆褐固氮菌，其16SrDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种圆褐固氮菌，其16SrDNA的基因序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的圆褐固氮菌，其特征在于，所述圆褐固氮菌的菌株为SINOPEC12，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNO：M2016110。3.根据权利要求1或2所述的圆褐固氮菌，其特征在于，所述圆褐固氮菌的生物学特性为：在固体培养基上的菌落呈圆形、半透明、表面光滑、中间凸起、粘稠状，显微镜下的细胞形态呈杆状、周生鞭毛、有荚膜，革兰氏染色反应呈阴性。4.根据权利要求3所述的圆褐固氮菌，其特征在于，所述的固体培养基为甲醇固体培养基或丁醇固体培养基；所述固体培养基的pH值为7-8。5.根据权利要求1-4中任一项所述的圆褐固氮菌，其特征在于，所述圆褐固氮菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关。6.一种鉴定如权利要求1-5中任一项所述圆褐固氮菌的方法，其包括对待测菌株进行16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列测序，并且所述待测菌株的16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列与如SEQIDNO.1的序列的一致性在95％以上，优选所述待测菌株的16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列与如SEQIDNO.1的序列的一致性在97％以上，更优选所述待测菌株的16SrDNA序列或16SrDNA的部分序列与如SEQIDNO.1的序列的一致...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，顾磊，许科伟，高俊阳，汤玉平，卢丽，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司石油勘探开发研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11