检测伤口微生物感染制造技术

所公开的技术涉及用于检测伤口，例如慢性伤口或感染伤口的化学实体，所述化学实体包含组合物、底物、试剂盒、敷料材料和制品，以及含有这类化合物的系统。所公开的技术进一步涉及在诊断测定中以及基于对特定部分和/或反应位点的酶促作用诊断和/或检测慢性或感染伤口中，使用这些组合物、试剂盒和系统的方法。额外的公开涉及基于多种标记物的表达表征伤口并使用这种信息治疗、管理和跟踪患有慢性或感染伤口的患者的方法。

Detection of wound microbial infection

The disclosed technology relates to chemical entities for detecting wounds, such as chronic wounds or infected wounds, comprising compositions, substrates, kits, dressing materials and products, and systems containing such compounds. The disclosed techniques further involve the use of these compositions, kits and systems in diagnostic tests and in the diagnosis and/or detection of chronic or infectious wounds based on enzymatic effects on specific parts and/or reaction sites. Additional disclosure involves representing wounds based on the expression of multiple markers and using this information to treat, manage and track patients with chronic or infectious wounds.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测伤口微生物感染相关申请的交叉引用本申请要求于2016年3月30日提交的美国临时申请号62/315,546和于2016年3月30日提交的美国62/315,556的权益，所述公开通过引用以其整体并入本文并成为其一部分。
本文描述的实施例总体上涉及伤口愈合，并且特别涉及用于检测和治疗伤口的组合物和方法。
技术介绍
在哺乳动物中，皮肤损伤引发有组织的复杂级联的细胞和生化事件，导致伤口愈合。伤口愈合是复杂的动态过程，可以恢复解剖学的连续性和功能：理想的愈合伤口是已经恢复正常解剖结构、功能和外观的伤口。典型的伤口通过由四个阶段组成的模型愈合-“渗出”阶段、增殖阶段、修复阶段和上皮成熟(Hatz等人，《伤口愈合和伤口管理(WoundHealingandWoundManagement)》，斯普林格出版社，慕尼黑，1994年)或止血、炎症、增殖和重塑阶段(Nwomeh等人，《整形外科临床(Clin.Plast.Surg.)》1998,25,341)。炎症阶段对伤口愈合过程特别重要，其中伤口部位处的生化反应促进愈合，但也由于产生过量的蛋白酶而导致组织破坏。伤口感染导致愈合过程缓慢或停止。例如，伤口中的病原体可以产生毒素(例如，梭菌属物种)，生成有害的代谢物，像提高pH的氨(例如，变形杆菌物种)，激活或产生组织裂解酶如蛋白酶，或促进组织侵入，从而导致增加伤口的大小或严重程度。在最坏的情况下，病原体可能会离开伤口并导致脓毒症。为了保持对伤口慢性的检查，在临床和兽医环境中采用各种评估技术和/或工具。目前评估感染伤口的方法主要基于测定与伤口相关联的各种参数。例如，可以在视觉上评估伤口，可以进行长度和深度测量，可以在可用的情况下使用数字摄影以跟踪伤口的视觉状况和大小(Krasner等人，同上)。在临床实践中，感染的诊断基于对次要参数，如气味、局部疼痛的存在、热、肿胀、流出物和发红的测量。许多这些临床指标，如炎症和流出物，对伤口感染具有低预测价值。在其它情况下，可以使用实验室和/或临床诊断程序确定伤口部位处的致病菌群的一个或多个数量和一种或多种类型。在医院实验室擦拭伤口然后进行微生物学测试是确认细菌定植和鉴定与感染相关联的菌株的一种选择，从而允许处方正确的抗生素疗程。然而，此过程耗时且劳动强度大。感染诊断的延迟可以延迟抗生素的使用，并可能增加脓毒症的发生风险。与现有临床诊断相关联的最大缺点之一是与感染发作和检测时间相关联的滞后。例如，使用擦拭程序对感染的阳性鉴定通常取决于在伤口部位处获得微生物的“临界质量”，并且因此在达到可检测水平之前不能进行早期检测。而且，拭子可能被周围组织的菌群污染，从而使诊断程序复杂化。其它缺点包含例如抽样误差、拭子传输的延迟、分析程序中的错误和/或报告中的错误。参见Bowler等人的评论《临床微生物学评论(ClinMicrobiolRev.)》14(2):244–269,2001。因此，对于能够早期诊断临床感染的诊断试剂和方法存在迫切但未满足的需求，优选地，其允许在表现出感染的临床症状之前进行临床诊断。还存在对将有助于在临床症状出现之前预测伤口的临床感染的组合物和方法的需求。这种预兆辅助将允许在伤口恶化之前通过适当的治疗(例如，抗微生物治疗)进行早期干预，并且需要手术或其它剧烈干预以预防进一步感染。此外，如果临床医生能够尽可能早地对伤口感染做出反应，那么也可以用最少的抗生素使用来治疗感染。这将减少住院治疗的需要，并且例如由于与其它患病受试者接触而降低继发感染的风险。
技术实现思路
本文所公开的技术提供了用于检测感染和/或慢性伤口的组合物和方法。所公开的技术通过以下方式改进现有测定：增加感染伤口检测的灵敏度、精确度和特异性；提供用于定性和定量测量的能力；以及，提高原位和实时检测感染伤口的速度。本文所描述的测定和方法部分地基于使用检测存在于感染或慢性伤口中的生物标记物和/或探针的具体试剂。检测过程可以涉及使用对感染伤口中，而不是非感染或非慢性伤口中存在的标记物特异性的试剂，并且检测步骤可以涉及当探针被标记物作用时生成的一个或多个信号的定性或定量测量。在其中检测方法涉及检测伤口中存在的酶的实施例中，探针包括对酶特异的修饰酶底物，所述修饰酶底物生成可以被任选地放大的信号。这极大地提高了检测的效率和特异性。此外，可以使用多种检测探针，每种检测探针特异于一种或多种靶标，例如对伤口特异的酶。这极大地有助于最大化诊断测定的效率和准确性，同时最小化假阳性的发生率(例如，由于非特异性相互作用和/或目标冗余)。更进一步，本文所公开的实验结果证实，新型探针和基于其的测定技术能够检测和表征各种类型的伤口。最后，所公开的技术的试剂可以与治疗分子如抗生素、抗真菌剂等一起使用，以监测和评估慢性伤口的治疗和管理。本文所描述的实施例部分地基于发现：免疫系统的细胞，包含由此生成的酶，可以在伤口的早期诊断中用作标记物。这些细胞，例如嗜中性粒细胞，在伤口部位处募集以对抗感染，通过吞噬细菌(和其它病原体)和/或用酶中和它们来实现。一些酶对蛋白质具有特异性(例如，弹性蛋白酶、组织蛋白酶G)，其它酶对细胞壁组分(例如，溶菌酶)具有特异性，而其它酶则介导蛋白质变性(例如，NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶(MPO)和其它过氧化物酶)。这些细胞，例如嗜中性粒细胞，通常只是短暂存活的，并且当它们在感染区域裂解时，它们释放其包含酶的溶酶体的内容物，然后可以检测所述酶以提供对伤口状态的可靠测量。因此，本文所描述的各种实施例利用酶标记物的检测，所述酶标记物指示在相关生物样品例如伤口组织中存在骨髓细胞和特别是嗜中性粒细胞。因此，这种酶在伤口流体中增加的水平或活性与增强的细菌挑战和有利于侵入性细菌的受干扰的宿主/细菌平衡的表现相对应。在一个实施例中，本文所提供的是包括具有结构A-I(式I)的化合物的化学实体，其中A是锚；并且I是指示剂区域。在另一个实施例中，本文所提供的是包括具有结构A-I(式I)的化合物的化学实体，其中所述锚A通过共价相互作用与所述指示剂I共价关联以形成识别位点S。在另一个实施例中，本文所提供的是包括具有结构A-I(式I)的化合物的化学实体，其中所述锚A通过共价相互作用与所述指示剂I共价关联以形成识别位点S，并且其中所述识别位点(S)对伤口特异性水解酶是特异性的。在此实施例下，所述水解酶是糖苷酶或蛋白酶。特别是在此实施例下，所述蛋白酶是弹性蛋白酶、组织蛋白酶G或髓过氧化物酶。在另一个实施例中，本文所提供的是包括具有结构A-I(式I)的化合物的化学实体，其中A是锚；并且I是指示剂区域，其中所述锚A包括多糖、纤维素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、肽聚糖、或壳聚糖、或其单体、其低聚物、其衍生物、其混合物或组合。在另一个实施例中，本文所提供的是包括具有结构A-I(式I)的化合物的化学实体，其中A是锚；并且I是指示剂区域，其中所述锚A包括壳聚糖、或其单体、其低聚物、其衍生物、其混合物或组合。在另一个实施例中，本文所提供的是包括具有结构A-I(式I)的化合物的化学实体，其中A是锚；并且I是指示剂区域，其中所述锚A包括壳聚糖的单体，所述壳聚糖的单体包括D-葡萄糖胺或N-乙酰基-D-葡萄糖胺、其低聚物、或其组合。在另一个实施例中，本文所提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学实体，其包括式I化合物：A–I式I其中A是锚；I是指示剂区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.30 US 62/315556;2016.03.30 US 62/3155461.一种化学实体，其包括式I化合物：A–I式I其中A是锚；I是指示剂区域。2.根据权利要求1所述的化学实体，其中所述锚A通过共价相互作用与所述指示剂I共价关联以形成识别位点S。3.根据权利要求2所述的化学实体，其中所述S对伤口特异性水解酶具有特异性。4.根据权利要求1所述的化学实体，其中A包括多糖、纤维素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、肽聚糖、或壳聚糖、或其单体、其低聚物、其衍生物、其混合物或组合。5.根据权利要求4所述的化学实体，其中所述锚A包括壳聚糖、或其单体、其低聚物、其衍生物、其混合物或组合。6.根据权利要求5所述的化学实体，其中所述壳聚糖的单体包括D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-葡萄糖胺、其低聚物、或其组合。7.根据权利要求5所述的化学实体，其中所述壳聚糖包括至少两个单元的D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺或其组合。8.根据权利要求5所述的化学实体，其中所述壳聚糖衍生物包括随机取代的部分N-、部分O-乙酰化壳聚糖、壳聚糖寡糖、羧甲基壳聚糖或羟烷基壳聚糖。9.根据权利要求8所述的化学实体，其中所述壳聚糖衍生物包括随机取代的部分N-、部分O-乙酰化壳聚糖。10.根据权利要求9所述的化学实体，其中所述壳聚糖衍生物是乙酰化壳聚糖，所述乙酰化壳聚糖包括约40％到约90％之间的乙酰化度(DA)。11.根据权利要求9所述的化学实体，其中所述壳聚糖衍生物是乙酰化壳聚糖，所述乙酰化壳聚糖包括大于50％的乙酰化度(DA)。12.根据权利要求9所述的化学实体，其中所述壳聚糖衍生物是卤代的。13.根据权利要求5所述的化学实体，其中所述锚A包括壳聚糖化合物或其衍生物，所述衍生物选自由以下组成的组：壳聚糖、N-乙酰基壳聚糖；寡-β-D-1,4-葡萄糖胺；乙酰基-D-吡喃葡萄糖苷；N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)；葡萄糖胺二聚体(GlcNAc)2；乙酰基壳聚糖；壳二糖八乙酸酯；包括结构(GlcNAc)n的壳寡糖，其中n＝4、5或6；壳寡糖；2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖苷；2-脱氧-3,4,6-三-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖苷；其低聚物；或其组合。14.根据权利要求1所述的化学实体，其中所述指示剂(I)或其中附着到所述锚的基序是糖苷酶的底物。15.根据权利要求12所述的化学实体，其中所述指示剂(I)或其中附着到所述锚的基序是糖苷酶的底物，所述糖苷酶是溶菌酶。16.根据权利要求15所述的化学实体，其中所述指示剂(I)或其中的基序附着到壳聚糖或其单体、其低聚物或其衍生物的1α-碳。17.根据权利要求1所述的化学实体，其中所述指示剂包括含有磺酰基乙基-硫酸氢酯-反应性基团的染料或含有二氯三嗪反应性基团的染料。18.根据权利要求17所述的化学实体，其中含有磺酰基乙基-硫酸氢酯-反应性基团的所述染料是反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5或反应性橙16或其组合。19.根据权利要求17所述的化学实体，其中含有二氯三嗪反应性基团的所述染料是反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19或反应性棕10或其组合。20.根据权利要求1所述的化学实体，其中所述指示剂包括选自由以下组成的组的可检测标记：发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光猝灭剂、脂质、有色分子、放射性同位素、闪烁剂、生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、蛋白质A、蛋白质G、抗体或其片段、多组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属和酶。21.根据权利要求1所述的化学实体，其中所述锚A通过糖苷键直接与所述指示剂I缀合。22.根据权利要求21所述的化学实体，其中所述锚包括选自由以下组成的组的化合物：壳聚糖、N-乙酰基壳聚糖；寡-β-D-1,4-葡萄糖胺；乙酰基-D-吡喃葡萄糖苷；N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)；葡萄糖胺二聚体(GlcNAc)2；乙酰基壳聚糖；壳二糖八乙酸酯；包括结构(GlcNAc)n的壳寡糖，其中n＝4、5或6；壳寡糖；2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖苷；2-脱氧-3,4,6-三-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖苷；或其组合。23.根据权利要求21所述的化学实体，其中所述指示剂选自由以下组成的组：反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5或反应性橙16、反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10、或其组合。24.根据权利要求1所述的化学实体，其中所述指示剂包括来自纤维二糖水解酶I(里氏木霉(Trichodermareesei))的亲水性结合模块(CBM)或来自聚羟基链烷酸酯解聚酶(粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis))的疏水性结合模块(PDB)或其嵌合变体。25.根据权利要求24所述的化学实体，其中所述锚包括纤维素或其衍生物或聚对苯二甲酸乙二醇酯或其衍生物。26.根据权利要求25所述的化学实体，其中所述指示剂包括来自纤维二糖水解酶I(里氏木霉)的亲水性结合模块(CBM)，并且所述锚包括纤维素或其衍生物，，其中所述指示剂与所述锚亲水缔合。27.根据权利要求24所述的化学实体，其中所述指示剂包括聚羟基链烷酸酯解聚酶(粪产碱菌)，并且所述锚包括聚对苯二甲酸乙二醇酯或其衍生物，其中所述指示剂与所述锚疏水缔合。28.一种包括多核苷酸序列的嵌合构建体，所述多核苷酸序列编码trxA(硫氧还蛋白)或其部分、编码组氨酸标签的间隔子序列和肠激酶切割位点或其部分。29.根据权利要求28所述的嵌合构建体，其中所述多核苷酸包括trxA基因。30.根据权利要求28所述的嵌合构建体，其中所述间隔子包括多组氨酸标签。31.根据权利要求28所述的嵌合构建体，其中所述间隔子包括六聚组氨酸(His6)标签。32.根据权利要求28所述的嵌合构建体，所述嵌合构建体包括肠激酶切割位点(AspAspAspLys)。33.根据权利要求28所述的嵌合构建体，所述嵌合构建体进一步包括elasub1序列。34.根据权利要求28所述的嵌合构建体，其中所述elasub1序列位于所述肠激酶切割位点之后。35.根据权利要求28所述的嵌合构建体，其中所述elasub1序列编码选自由以下组成的组的功能性氨基酸：半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。36.根据权利要求33所述的嵌合构建体，其进一步包括编码直接位于所述elasub1序列下游的亲水性结合模块(CBM)的核酸。37.根据权利要求33所述的嵌合构建体，其进一步包括编码直接位于所述elasub1序列下游的疏水性粪产碱菌聚羟基链烷酸酯解聚酶(PDM)的核酸。38.根据权利要求36所述的嵌合构建体，其进一步包括编...

【专利技术属性】
技术研发人员：M伯内特，A海茵茨尔，E西格尔，D卢施尼特，C加默里特，G特格尔，G居比茨，
申请(专利权)人：定性酶诊断有限责任两合公司，维也纳自然资源和生命科学大学，奥地利工业生物技术中心有限责任公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT